يبني هذا الإجراء نموذجا أدنى للخلية الخالية من اللوائح الكيميائية الحيوية المعقدة. يمكن للتقنية المستخدمة توليد إنتاجية عالية من الجسيمات الشحمية ولها كفاءة تغليف عالية لبروتينات الهيكل الخلوي. يمكن تطبيق هذا الإجراء على تغليف مجموعة متنوعة من البروتينات والأشياء الكبيرة مثل الجسيمات الدقيقة والسباحين الصغار الذين يستعدون ذاتيا.
يكافح الفرد لزيادة العائد الشحمي للمحاولات العديدة الأولى. يوصى بمناقشة قسم المخطوطة بانتظام لمزيد من التفاصيل لزيادة العائد. للبدء ، قم بإعداد المخزن المؤقت الداخلي المائي غير البلمرة بحجم إجمالي قدره خمسة ملليلتر عن طريق خلط 0.1 ملليمولار CACL اثنين ، و 10 ملليمولار HEPES ، و DTT واحد مللي مولا ، و 0.5 ملليمول DAPCO ، و 320 مللي مولا سكروز ، و 0.2 ملليمولار ATP.
تحضير مزيج البروتين عن طريق إضافة البروتينات إلى المخزن المؤقت الداخلي غير البلمرة عند أربع درجات مئوية. لتشكيل طبقة الأكتين ، أضف 100 نانومولار جيلكالين ، وأربعة سعال ميكرومولار ، و 2.2 ميكرومولار VCA HEZ إلى مزيج البروتين. كتجربة تحكم ، استبدل مزيج البروتين ب 100 ميكروغرام لكل صبغة فلورسنت ملليلتر.
تحضير مخزن البلمرة الداخلي المائي في حجم إجمالي قدره خمسة ملليلترات عن طريق خلط 100 ملليمول كلوريد البوتاسيوم. أربعة ملليمولار كلوريد المغنيسيوم ، 10 ملليمولار هيبس ، واحد ملليمولار DTT ، 0.5 ملليمولار DABCO ، 10 ملليمولار ATP و 80 مللي مولا السكروز. قم بإعداد المخزن المؤقت النهائي عن طريق خلط المخزن المؤقت الداخلي غير البلمرة والمخزن المؤقت الداخلي للبلمرة بنسبة حجم واحد إلى واحد ، لإنتاج المحلول المائي الداخلي بحجم إجمالي قدره 30 ميكرولتر سيتم تغليفه داخل الجسيمات الشحمية.
تحضير المخزن الخارجي المائي في حجم إجمالي قدره 150 ميكرولتر عن طريق خلط 10 ملليمولار HEPES ، 50 ملليمولار كلوريد البوتاسيوم ، اثنين من كلوريد المغنيسيوم ملليمولار ، 0.2 ملليمولار كلوريد الكالسيوم ، اثنين من ملليمولار ATP ، واحد ملليمولار DTT ، 0.5 ملليمولار DAPCO ، 212 ملليمولار الجلوكوز و 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر غلاف بيتا. لتحضير خليط زيت الدهون ، ابدأ بإضافة 100 ميكرولتر من 25 ملليغرام لكل ملليلتر EGGPC إلى قارورة زجاجية. تبخر الكلوروفورم بغاز الأرجون تاركا طبقة دهنية صلبة جافة في أسفل القارورة.
لتشكيل طبقة أكتين ، أضف دهون النيكل بنسبة 10 إلى واحدة من EGGPC إلى دهون النيكل واخلطها ، قبل تبخر الكلوروفورم. أضف ملليلترين من الزيوت المعدنية. تبخر الكلوروفورم وسونيك خليط زيت الدهون في درجة حرارة الغرفة في الحمام لمدة ساعة واحدة ، لإعادة تعليق الدهون.
قم بإعداد مخزن مؤقت نهائي في مستحلب الزيت لإعداد قطرات دهنية أحادية الطبقة تحتوي على البروتين محل الاهتمام. ابدأ بأخذ 100 ميكرولتر من خليط زيت الدهون في أنبوب بلاستيكي وأضف 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت النهائي إلى خليط زيت الدهون. تأكد من أن المخزن المؤقت النهائي في قطرة واحدة.
باستخدام حقنة زجاجية ، اسحب كمية صغيرة من خليط زيت الدهون أولا ثم القطيرة العازلة النهائية عن طريق وضع طرف المحقنة في محيط القطيرة لتقسيمها إلى قطرات صغيرة. قم بالشفط بلطف لأعلى ولأسفل عدة مرات حتى يتم تشكيل مستحلب غائم. ضع 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت الخارجي في أنبوب بلاستيكي منفصل.
ضع 30 ميكرولتر من خليط زيت الدهون فوق المخزن الخارجي واتركه لمدة 10 دقائق تقريبا لتطوير طبقة أحادية الدهون على الواجهة. لإعداد الجسيمات الشحمية ، أضف بعناية 50 ميكرولتر من مستحلب الزيت العازل النهائي ، إلى المرحلة العليا من الزيت في الأنبوب. الطرد المركزي للأنبوب البلاستيكي في 100 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
تغيير الوقت وسرعة الطرد المركزي ، لتحسين تكوين الجسيمات الشحمية. قم بإزالة مرحلة الزيت بعناية عن طريق ماصة تستنشق حجما إضافيا إذا لزم الأمر. تأكد من عدم وضع طرف الماصة على جانب الأنبوب لتجنب إنشاء غضروف مفصلي من الزيت فوق مرحلة الجسيمات الشحمية.
باستخدام ماصة جديدة ، اقطع طرف الماصة. قم بلصق الماصة ببطء في المرحلة السفلية المتبقية وقم بشفط الحجم المائي لجمع الجسيمات الشحمية. صب 100 ميكرولتر من العازل الخارجي في بئر غرفة الحضانة.
قم بإيداع الجسيمات الشحمية المجمعة بلطف في المخزن المؤقت الخارجي ثم ضع غطاء آخر أعلى الغرفة. راقب الجسيمات الشحمية باستخدام مجهر متحد البؤرة باستخدام هدف غمر الزيت 63 ×. استخدم خطوط الليزر 488 و 647 و 561 نانومتر.
لمراقبة الدهون الموسومة بالفلورسنت ، صبغة الفلورسنت المغلفة والأكتين المغلف المسمى بالفلورسنت على التوالي. التقط الإطارات المثيرة للاهتمام واحفظ الصور بتنسيق TIF. معالجة وتحليل الصور في الصورة J.Start عن طريق فتح ملف TIF، وذلك باستخدام برنامج الصورة J.
انتقل إلى الصورة، ثم انقر على ضبط. متبوعا بتباين السطوع، اضبط سطوع الصورة وتباينها على المقياس المطلوب عن طريق ضبط الحد الأدنى والحد الأقصى للإعدادات ومنزلقات السطوع والتباين. انقر على أداة تحديد المستطيل في شريط الأدوات وحدد المنطقة محل الاهتمام.
انتقل إلى الصورة، ثم انقر على اقتصاص لاقتصاص عائد الاستثمار. انتقل إلى التحليل، ثم انقر على تعيين المقياس. في النافذة المنبثقة، أدخل 1.0 في حقل نسبة أبعاد البكسل واضبط الميكرومتر كوحدة طول.
في حقل المسافة بالبكسل، أدخل عرض الصورة بالبكسل. في حقل المسافة المعروفة، أدخل عرض الصورة الحقيقي بالميكرون. لقياس حجم الجسيم الشحمي ، باستخدام أداة التحديد البيضاوي في شريط الأدوات ، ارسم دائرة على طول حافة الجسيم الشحمي.
انتقل إلى التحليل ، ثم انقر فوق قياس ، لقياس مساحة الدائرة ، والتي يمكن من خلالها حساب قطر الجسيمات الشحمية. يتم التحقق من نجاح توليد الجسيمات الشحمية من خلال تصور الحلقة الدائرية الرقيقة التي هي الطبقة الثنائية من الدهون الفلورية الخضراء. تحت ليزر 488 نانومتر باستخدام المجهر البؤري لتأكيد تغليف صبغة الفلورسنت.
يجب أن تكون البيئة الداخلية للجسيمات الشحمية فلورية بشكل موحد تحت ليزر 647 نانومتر. يمكن تصور تكوين الجسيمات الشحمية بواسطة الحلقات الدائرية الخضراء الرقيقة. التأثير المعاد تشكيله في الشبكات داخل الجسيمات الشحمية غير متجانس ، ويظهر على شكل هياكل شبكة متفرعة من خيوط الأكتين.
تم تشغيل بنية الفرع من خلال إدخال ARP اثنين من ثلاثة مجمعات ، والتي تتحكم في وقت واحد في نواة وتفرع خيوط الأكتين ، جنبا إلى جنب مع VCA HEZ. يتم إنشاء طبقة أكتين رقيقة ، ولكن متفرعة بكثافة في النشرة الداخلية للطبقة الثنائية من الجسيمات الشحمية التي يمكن تصورها على أنها فلورسنت. يجب ضخ خليط المخزن المؤقت النهائي للصوت الدهني بشكل عام ذهابا وإيابا من خلال حقنة زجاجية ، لتجنب إدخال فقاعات الهواء.
يجب أن يكون الخليط أبيض بعد العملية. مهدت هذه التقنية الطريق لبناء نموذج الحد الأدنى من الخلية ، خال من اللوائح الكيميائية الحيوية المعقدة. باستخدام نظام محاكاة الخلية هذا ، يمكن للباحثين استكشاف الخصائص الميكانيكية والديناميكية لبروتينات الهيكل الخلوي والنواة والمحرك الجزيئي.
