이 조치는 복잡한 생화학 적 규제가없는 세포의 최소 모델을 구축합니다. 사용 된 기술은 높은 수율의 리포좀을 생성 할 수 있으며 세포 골격 단백질에 대한 높은 캡슐화 효율을 가질 수 있습니다. 이 측정은 다양한 단백질과 미세 입자 및 자체 준비 마이크로 수영 선수와 같은 큰 물체의 캡슐화에 적용될 수 있습니다.
개인은 처음 몇 번의 시도 동안 리포좀 수율을 높이는 데 어려움을 겪고 있습니다. 수율을 높이기 위해 자세한 내용은 원고의 섹션을 정기적으로 토론하는 것이 좋습니다. 시작하기 위해, 0.1 밀리몰 CACL 2, 10 밀리몰 HEPES, 1 밀리몰 DTT, 0.5 밀리몰 DAPCO, 320 밀리몰 수크로스 및 0.2 밀리몰 ATP를 혼합함으로써 총 부피 5 밀리리터의 수성 내부 비중합 완충액을 제조한다.
섭씨 4도에서 내부 비중합 완충액에 단백질을 첨가하여 단백질 혼합물을 준비합니다. 액틴 층을 형성하려면 100 나노 몰 겔 칼린, 4 마이크로 몰 코 팔린 및 2.2 마이크로 몰 VCA HEZ를 단백질 혼합물에 첨가하십시오. 대조 실험으로 단백질 혼합물을 밀리리터당 100마이크로그램 형광 염료로 대체합니다.
100 밀리몰 염화칼륨을 혼합하여 총 부피 5 밀리리터의 수성 내부 중합 완충액을 준비한다. 4 밀리몰 염화 마그네슘, 10 밀리몰 hepes, 1 밀리몰 DTT, 0.5 밀리몰 DABCO, 10 밀리몰 ATP 및 80 밀리몰 자당. 내부 비중합 완충액과 내부 중합 완충액을 1:1의 부피비로 혼합하여 최종 완충액을 준비하고, 리포좀 내에 캡슐화될 총 부피의 내부 수용액을 수득한다.
10 밀리몰 HEPES, 50 밀리몰 염화칼륨, 2 밀리몰 마그네슘 클로라이드, 0.2 밀리몰 칼슘 클로라이드, 2 밀리몰 ATP, 1 밀리몰 DTT, 0.5 밀리몰 DAPCO, 212 밀리몰 포도당 및 0.1 밀리리터 베타 케이싱을 혼합함으로써 총 부피 150 마이크로리터의 수성 외부 완충액을 준비한다. 지질 오일 혼합물을 준비하려면 먼저 EGGPC 밀리리터 당 25 밀리그램의 100 마이크로 리터를 유리 바이알에 첨가하십시오. 아르곤 가스로 클로로포름을 증발시켜 바이알 바닥에 건조한 고체 지질 필름을 남깁니다.
액틴 층을 형성하려면 클로로포름이 증발하기 전에 EGGPC와 니켈 지질의 비율을 10:1로 니켈 지질에 첨가하고 혼합합니다. 미네랄 오일 2 밀리리터를 첨가하십시오. 클로로포름을 증발시키고 지질 오일 혼합물을 실온에서 1시간 동안 수조에서 초음파 처리하여 지질을 재현탁시킨다.
관심있는 단백질을 함유하는 단일층 지질 방울을 제조하기 위해 오일 에멀젼에서 최종 완충액을 준비한다. 플라스틱 튜브에 100 마이크로리터의 지질 오일 혼합물을 취하여 시작하고 10 마이크로리터의 최종 완충액을 지질 오일 혼합물에 첨가합니다. 최종 버퍼가 하나의 액적에 있는지 확인하십시오.
유리 주사기를 사용하여 소량의 지질 오일 혼합물을 먼저 그린 다음 주사기 끝을 물방울 주변에 배치하여 최종 완충액 방울을 추출하여 작은 물방울로 분해합니다. 흐린 에멀젼이 형성 될 때까지 위아래로 부드럽게 여러 번 흡인하십시오. 30 마이크로 리터의 외부 버퍼를 별도의 플라스틱 튜브에 넣으십시오.
30마이크로리터의 지질 오일 혼합물을 외부 완충액 위에 놓고 약 10분 동안 그대로 두어 계면에서 지질 단층을 형성합니다. 리포좀을 준비하려면 최종 버퍼 오일 에멀젼 50 마이크로 리터를 튜브의 상단 오일 상에 조심스럽게 첨가하십시오. 플라스틱 튜브를 섭씨 4도에서 15분 동안 100배 G로 원심분리합니다.
리포좀 형성을 최적화하기 위해 시간과 원심분리 속도를 변경합니다. 필요한 경우 피펫으로 추가 부피를 흡인하여 오일 상을 조심스럽게 제거합니다. 리포좀 상 위에 메니스커스 오일이 생성되지 않도록 피펫 팁을 튜브 측면에 두지 않도록 하십시오.
새 피펫으로 피펫의 끝을 자릅니다. 피펫을 나머지 바닥 단계에 천천히 붙이고 수성 부피를 흡인하여 리포좀을 수집합니다. 100 마이크로 리터의 외부 완충액을 배양 챔버의 웰에 붓습니다.
수집된 리포좀을 외부 완충액에 부드럽게 증착한 다음 챔버 위에 다른 커버 슬립을 놓습니다. 63 x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 컨포칼 현미경으로 리포좀을 관찰합니다. 488, 647 및 561 나노 미터 레이저 라인을 사용하십시오.
형광 표지된 지질, 캡슐화된 형광 염료 및 캡슐화된 형광 표지된 액틴을 각각 관찰하였다. 관심 프레임을 캡처하고 이미지를 TIF 형식으로 저장합니다. 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 TIF 파일을 열어 이미지 J.Start의 이미지를 처리하고 분석합니다.
이미지로 이동한 다음 조정을 클릭합니다. 밝기 대비가 끝나면 최소 및 최대 설정과 밝기 및 대비 슬라이더를 조정하여 이미지의 밝기와 대비를 원하는 배율로 조정합니다. 도구 모음에서 사각형 선택 도구를 클릭하고 관심 영역을 선택합니다.
이미지로 이동한 다음 자르기를 클릭하여 ROI를 자릅니다. 분석으로 이동한 다음 배율 설정을 클릭합니다. 팝업 창에서 픽셀 종횡비 필드에 1.0을 입력하고 마이크로미터를 길이 단위로 설정합니다.
픽셀 단위의 거리 필드에 이미지 너비를 픽셀 단위로 입력합니다. 알려진 거리 필드에 실제 이미지 너비를 미크론 단위로 입력합니다. 리포좀의 크기를 측정하려면 도구 모음의 타원형 선택 도구를 사용하여 리포솜의 가장자리를 따라 원을 그립니다.
분석으로 이동 한 다음 측정을 클릭하여 리포솜의 직경을 계산할 수있는 원의 면적을 측정합니다. 성공적인 리포좀 생성은 녹색 형광 지질 이중층인 얇은 원형 링의 시각화를 통해 확인됩니다. 488 나노미터 레이저 하에서 공초점 현미경을 사용하여 형광 염료의 캡슐화를 확인했습니다.
리포좀의 내부 환경은 647 나노 미터 레이저 하에서 균일하게 형광을 발해야합니다. 리포좀의 형성은 얇은 녹색 원형 고리로 시각화 할 수 있습니다. 리포좀 내부의 네트워크에서 재구성 된 영향은 이질적이며 액틴 필라멘트의 분기 된 네트워크 구조로 나타납니다.
분기 아키텍처는 VCA HEZ와 함께 액틴 필라멘트의 핵 생성 및 분기를 동시에 제어하는 ARP 2 3 복합체의 도입으로 촉발되었습니다. 얇지만 조밀하게 분지된 액틴 층은 형광등으로 시각화될 수 있는 리포좀의 이중층의 내부 전단지에 생성됩니다. 지질 오디오 최종 완충액 혼합물은 일반적으로 기포가 유입되지 않도록 유리 주사기를 통해 앞뒤로 펌핑되어야 합니다.
혼합물은 공정 후 희끄무레해야합니다. 이 기술은 복잡한 생화학 적 규제가없는 세포의 최소 모델을 구축하기위한 길을 열었습니다. 이 세포 모방 시스템을 통해 연구자들은 세포 골격 단백질, 핵 장치 및 분자 모터의 기계적 및 동적 특성을 탐구 할 수 있습니다.
