سيسمح هذا النموذج للباحثين في المراحل قبل السريرية الحرجة بتحديد فعالية مضادات الميكروبات للتركيبات الجديدة بدقة أكبر ، ويمنح الباحثين تحكما أكبر في تصميم الأدوية وصياغتها. يتيح هذا النموذج نتائج سريعة قابلة للتكرار في بيئة جرح تمثيلية. يقلل من الحاجة إلى الحيوانات المرباة لهذا الغرض ، ويسهل الترجمة الأسرع لمضادات الميكروبات الموضعية لالتهابات الجروح إلى العيادة.
التحديات الرئيسية هي التلوث والبراعة. من الضروري اتباع تقنية تعقيم صارمة والصبر على معالجة الأنسجة ؛ هناك حاجة إلى إزالة السديلة الدقيقة والهادفة لنجاح هذه الطريقة. ابدأ بتطهير الملقط بتعريضه للتعقيم الحراري الجاف عند 200 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
الأوتوكلاف جميع الأواني الزجاجية عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام. قم بتطهير قسم الجبهة من المصباح عن طريق سكب ما يقرب من 100 ملليلتر من محلول ثاني أكسيد الكلور 200 جزء في المليون على منطقة العينة. احلق قسم الجبهة باستخدام كليبرز كهربائي ، متبوعا بغسل 200 مل من محلول ثاني أكسيد الكلور 200 جزء في المليون.
امسح المنطقة باستخدام الإيثانول ولفافة زرقاء ، وقم بتغطية منطقة العينة بكريم إزالة الشعر. بعد 35 دقيقة ، اكشط كريم إزالة الشعر برفق باستخدام أداة كشط وقم بتقييم منطقة العينة. كرر عملية إزالة الشعر إذا بقيت كمية كبيرة من الشعر.
اشطف منطقة العينة النظيفة ب 200 ملليلتر من محلول ثاني أكسيد الكلور متبوعا بالإيثانول ولفافة زرقاء. استخدم لكمة خزعة معقمة بحجم ثمانية ملليمترات لقطع عينة جلد ثمانية ملليمترات من المنطقة المعدة. ثم قم بإزالة العينة باستخدام ملقط معقم ومشرط شفرة رقم 15 ، مما يضمن إزالة جميع الدهون الجلدية.
ضع العينات في جرة معقمة سعة 0.5 لتر مملوءة ببرنامج تلفزيوني معقم. ثم انقلها إلى أنابيب معقمة سعة 50 ملليلتر مملوءة ب 50 ملليلتر من محلول ثاني أكسيد الكلور 200 جزء في المليون. اقلب الأنبوب مرتين واتركه ليعقم لمدة 30 دقيقة.
نقل العينات إلى أنبوب 50 ملليلتر مملوء ب 40 ملليلتر من PBS المعقم. بعد غسل PBS ، ضع كل عينة من الجلد في بئر منفصل من لوحة 24 بئر. أضف 350 ميكرولتر من الوسط الذي تم تسخينه مسبقا في بئر ، مع الحفاظ على العينة في واجهة الهواء والسائل.
قم بإغلاق الألواح المكونة من 24 بئرا بختم لوحة منفذة للغاز قبل وضع اللوحة للحضانة في حاضنة الأنسجة الرطبة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة ، قم بإزالة وسط الثقافة وشطف العينات في 500 ميكرولتر من PBS المعقمة. قم بإزالة المضادات الحيوية المتبقية من العينة عن طريق معالجتها بوسائط خالية من المضادات الحيوية بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
إذا ظهرت عكارة أو عدوى فطرية في الوسائط الخالية من المضادات الحيوية ، فتخلص من العينة. بعد ذلك ، قم بإعداد أنبوب سعة 50 ملليلتر مع 10 ملليلتر من مرق الصويا Tryptic المعقم. ثم انقل العديد من مستعمرات المكورات العنقودية الذهبية من صفيحة أجار طازجة من S.aureus إلى المرق ، واحتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة.
بعد طرد الأنابيب عند 4،000 G لمدة ثلاث دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من PBS المعقمة. كرر غسل PBS مرتين قبل ضبط اللقاح على كثافة بصرية 0.6 عند أطوال موجية 600 نانومتر باستخدام PBS معقم. تأكد من حمل اللقاح عن طريق عدد الألواح اليدوية القابلة للتطبيق.
لإصابة عينة الجلد ، قم بإعداد صفيحة جديدة من 24 بئرا تحتوي على 400 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المضادات الحيوية الدافئة مسبقا ، وأضف 24 إدخالا جيدا باستخدام ملقط معقم. قم بإزالة الوسائط من عينات الجلد. اغسلها ب 500 ميكرولتر من PBS المعقم وقم بإزالة الغسيل.
استخدم ملقط معقم لتثبيت العينة برفق في قاع البئر. استخدم خزعة مثقوبة بطول أربعة ملليمترات لاختراق عينة الجلد إلى عمق تقريبي يتراوح من ملليمتر إلى مليمترين وعمل رفرف جرح مركزي. ثم استخدم مشرط ذو شفرة 15 وملقط أنسجة Allis المعقم لإزالة الطبقة العليا من رفرف الجرح.
بمجرد إصابة جميع العينات ، قم بنقلها إلى 24 بئرا باستخدام ملقط معقم. ماصة 15 ميكرولتر من اللقاح البكتيري في سرير الجرح قبل الحضانة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة الأنسجة المرطبة. لفترات حضانة أطول ، قم بإزالة الوسائط ، واستبدلها بوسائط جديدة كل 24 ساعة ، واحتضان الألواح في نفس الظروف.
لتحديد الحمل البكتيري ، قم بإزالة الوسائط من قاع الآبار. وباستخدام ملقط معقم ، انقل كل عينة إلى أنبوب منفصل سعة 50 ملليلتر مملوء بملليلتر واحد من PBS المعقم. ثم افصل البكتيريا عن سطح طبقة الجرح عن طريق تجانس سطح العينة باستخدام خالط ذو رأس دقيق.
تأكد من أن سرير الجرح على اتصال مباشر بطرف الخالط. بمجرد معالجة جميع العينات ، قم بتدوير كل عينة قبل نقل 20 ميكرولترا من التجانس إلى البئر المقابل للوحة 96 بئرا تحتوي على 180 ميكرولتر من PBS المعقمة. قم بتخفيف كل عينة متجانسة بشكل تسلسلي إلى 1 في 10 إلى سالب 7 ، وماصة 10 ميكرولتر من التجانس المخفف على صفيحة أجار الصويا Tryptic في ثلاث نسخ.
احتضان صفيحة Tryptic Soy Agar عند 37 درجة مئوية ، وبعد 18 ساعة ، احسب عدد المستعمرات لتحديد وحدات تشكيل المستعمرة أو CFU لكل عينة. تم تحديد نظام تعقيم الجلد المناسب باستخدام علاجات مختلفة لفترات زمنية متفاوتة. تمت مراقبة سلامة الأنسجة عن طريق الأنسجة ، تليها تلطيخ مع الهيماتوكسيلين ويوزين مباشرة بعد العلاج.
كان العلاج لمدة 30 دقيقة بثاني أكسيد الكلور هو العلاج الأكثر فعالية ، مع تعقيم أنسجة الجلد القابلة للتكرار مع الحفاظ على سلامة الأنسجة. كان هناك فيلم أبيض في سرير الجرح واضحا على الأنسجة بعد 48 ساعة من الإصابة. على الرغم من أن نموذج الخدش كان يحتوي على متوسط أعلى لعدد وحدات CFU بعد 24 ساعة ، إلا أن تقنية إزالة الجرح السديلة أنتجت نتائج أكثر اتساقا.
بعد 48 ساعة ، تم استرداد ما يقرب من 100 مرة من وحدات CFU البكتيرية من الأنسجة المصابة مقارنة باللقاح ، مما يشير إلى إصابة ناجحة. أشارت أقسام الأنسجة الملطخة بالجرام من الأنسجة المصابة إلى وجود خلايا S.aureus في سرير الجرح ، والتي كانت غائبة في أقسام الأنسجة غير المصابة. بعد هذا الإجراء ، يمكن للمرء إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية لدراسة استجابة الأنسجة ، وصبغة الجرام المعدلة لتصور توطين البكتيريا ، وعدد الألواح القابلة للحياة بعد التعرض لمضادات الميكروبات لاختبار فعالية مضادات الميكروبات.
بالنسبة للباحثين الذين يطورون مضادات ميكروبات جديدة ، سيوفر هذا النموذج تحكما أكبر في تحسين الرصاص ، ويقلل من الاعتماد على التجارب الحيوانية المكلفة والمنظمة بإحكام ، ويمكن من الترجمة السريعة لمضادات الميكروبات إلى العيادة.
