يعمل هذا البروتوكول على تقليل حاجز الدخول لتجربة زراعة الخلايا ويمكن الباحثين من تقييم وتوصيف الطبقات الأحادية للخلايا الملتصقة المزروعة في بيئات الموائع الدقيقة الديناميكية. الميزة الأساسية لهذه التقنية هي أنها تمكن من التقييم النوعي والكمي لخصائص الخلية أحادية الطبقة لتكون بمثابة أساس لمزيد من التجارب المعتمدة على الطبقة الأحادية. تتيح هذه الطريقة تلخيص ظهارة سنخية في المختبر ، مما يسمح باستكشاف الاستجابات الديناميكية أثناء متلازمة الضائقة التنفسية الحادة ، ARDS ، وكذلك إصابة الرئة التي يسببها جهاز التنفس الصناعي ، VILI.
للبدء ، احصل على صفيف تدفق قناة واحدة. تنظيف سطح زجاج الغطاء في حمام بالموجات فوق الصوتية. اغمر غطاء الزجاج في بولي دي ليسين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
ثم جففه عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، ضع مواد لاصقة على الوجهين في فواصل مايلر. قطع الليزر كما هو موضح في المخطوطة إلى زجاج الغطاء والتأكد من محاذاة قواطع القناة بدقة.
قم بتثبيت غطاء زجاجي مستطيل على الشريط اللاصق السفلي. استخدم الأوراق اللاصقة المقشرة لتغطية أجزاء المادة اللاصقة التي لا تزال مكشوفة. بعد اكتمال التجميع ، قم بتطبيق ضغط ثابت ومتساو على البناء.
باستخدام حقنة مملوءة بالماء منزوع الأيونات ، اشطف القناة. تعقيم العلبة القناة في معقم الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. باستخدام تقنية معقمة ، عالج القناة بمحلول فيبرونيكتين البشري المحضر في برنامج تلفزيوني واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية.
في غطاء التدفق الصفحي المعقم ، قم بإعداد تعليق خلية NCI H441 باستخدام وسيط RPMI 1640 مع 10٪ FBS. استخدم 0.25 ملليلتر من تعليق الخلية هذا لملء القناة وجزء من المنافذ. باستخدام مجهر برايتفيلد ، تحقق من توزيع الخلايا بالتساوي داخل القنوات.
أضف خزان الوسائط والمحبس إلى القناة. ابدأ في زراعة القناة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استخدم مضخة حقنة قابلة للبرمجة لسحب الوسائط المستهلكة من القناة والوسائط الجديدة إلى القناة من خزان وسائط معقم متصل بمدخل القناة.
في غطاء دخان كيميائي ، قم بتخفيف محلول فورمالديهايد بنسبة 4٪ إلى DPBS لإنشاء محلول 1٪ وتخزينه في أنبوب يحمل علامة مناسبة. تحضير محلول الفورمالديهايد 2 ٪ بطريقة مماثلة. انقل محاليل الفورمالديهايد إلى محاقن ذات علامة مناسبة من خمسة ملليلترات.
ارسم 20 ملليلترا من DPBS في حقنة منفصلة سعة 20 ملليلتر والتي سيتم استخدامها لخطوات الغسيل. بعد ذلك ، قم بإزالة قناة الموائع الدقيقة من جهاز الاستزراع وتأمينها في غطاء الدخان الكيميائي. لتجميع جهاز التثبيت والتلوين ، قم بتوصيل جزء من أنابيب النقل بالمنفذ الجانبي لمحبس ثلاثي الاتجاهات عبر قفل Luer ذكر لمحول شوكة الخرطوم.
ثم قم بتوصيل المحبس بمنفذ مدخل صفيف التدفق. قم بتوصيل جزء آخر من أنابيب النقل بمنفذ مخرج المحبس الحالي باستخدام نفس النوع من محول شوكة الخرطوم. أخيرا ، قم بتأمين الأطراف الحرة لكلا أنبوبي النقل المخصصين الآن كخطوط نفايات في حاوية نفايات مناسبة للمواد الكيميائية والبيولوجية.
تأكد من أن المحبس يسد منفذ مدخل صفيف التدفق واغسل خط النفايات باستخدام DPBS. ثم أدر المحبس لسد خط النفايات واغسل الخلايا ببطء بملليلتر من DPBS. ادفع ببطء ملليلتر من 1٪ مثبت عبر القناة.
اتركه لمدة خمس دقائق وكرر مع 2٪ مثبت. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام DPBS طازجة كما هو موضح سابقا. تحضير محلول الصابونين 0.1٪ كما هو موضح في المخطوطة.
ضع DPBS إضافية في حقنة سعة 20 ملليلتر لاستخدامها في خطوات الغسيل. قم بتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم. أضف كاشف القضيب لتلطيخ الأكتين الخيطي وكاشف Hoechst لتلطيخ النواة إلى محلول الصابونين 0.1٪.
ثم نقل الحل إلى حقنة مغطاة احباط. اغسل خط النفايات بكمية صغيرة من محلول الاختراق والتلطيخ. ثم أدخل ملليلتر من المحلول إلى قناة الموائع الدقيقة.
قم بتغطية القناة بورق الألمنيوم لحجب الضوء. بعد 30 دقيقة ، اغسل محلول النفاذية بملليلتر من DPBS مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما قبل تجفيف القناة برفق. باستخدام ماصة صغيرة ، أدخل الحد الأدنى من مجموعة ناعمة مضادة للتلاشي إلى قناة الموائع الدقيقة لضمان تغطية السطح السفلي بالكامل.
ثم ختم نهاية القناة. باستخدام مجهر برايت فيلد ، تحقق بسرعة من سلامة طبقة الخلية قبل تخزين القناة في حاوية لحمايتها من الضوء. اختبر مواقع التصوير عن طريق إجراء عمليات مسح مرجعية ومكدسات z حتى يتم استيفاء معلمات وشروط الصورة المطلوبة.
باستخدام لوحة قاعدة صفيف التدفق كمرجع ، قم ببناء مكدسات z في مواقع مختلفة على طول القناة. أخيرا ، قم بتحليل بيانات المقطع العرضي وبيانات خريطة العمق وأي خصائص أخرى ذات صلة لتقييم خصائص طبقة الخلية. يظهر الاستخدام الناجح لهذه التقنية في بيئة الثقافة الديناميكية للسوائع الدقيقة من خلال الحصول على الصور على بعد سنتيمتر واحد على الأقل من المدخل والمخرج.
في تجربة مدة الاستزراع التمثيلي ، لوحظ إنتاج أحادي الطبقة ناجح عندما تم استزراع الخلايا لمدة 24 ساعة. ومع ذلك ، عند استزراعه لمدة 48 ساعة ، شوهد تكوين متعدد الطبقات غير مرغوب فيه. تكشف البيانات التي تم جمعها من كل موقع من مواقع تصوير قناة الموائع الدقيقة الخمسة أيضا عن العلاقة بين زيادة مدة الاستزراع وزيادة مساحة المقطع العرضي ، مما يشير إلى حدوث تكوين طبقة غير متساو أو نمو زائد في غضون 48 ساعة من الثقافة.
تم الحصول على خريطة عمق لموقع مركزي داخل قناة الموائع الدقيقة المستزرعة لمدة 24 ساعة ، وهو أمر مفيد للتقييم النوعي لخصائص الطبقة. الجوانب الثلاثة الأكثر أهمية لهذا البروتوكول هي البناء السليم للقناة ، والثقافة الدقيقة وظروف تدفق الوسائط ، والاستخدام الدقيق لجهاز التثبيت والتلطيخ. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى بالتوازي للتحقق من الجدوى التجريبية للطبقة الأحادية للخلية المنتجة مثل استشعار مقاومة الخلايا الكهربائية ، أو ECIS ، أو المقاومة الكهربائية عبر الظهارة ، TEER.
