Este protocolo sirve para reducir una barrera de entrada para la experimentación de cultivos celulares y permite a los investigadores evaluar y caracterizar monocapas celulares adherentes cultivadas en entornos microfluídicos dinámicos. La principal ventaja de esta técnica es que permite la evaluación cualitativa y cuantitativa de las características de la monocapa celular para servir como base para una mayor experimentación dependiente de la monocapa. Este método permite la recapitulación de un epitelio alveolar in vitro, lo que permite explorar las respuestas dinámicas durante el síndrome de dificultad respiratoria aguda, SDRA, así como la lesión pulmonar inducida por el ventilador, VILI.
Para comenzar, obtenga una matriz de flujo de un solo canal. Limpie la superficie del vidrio de la cubierta en un baño ultrasónico. Sumerja el vidrio de la cubierta en poli-d-lisina a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Luego séquelo a 60 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, coloque adhesivos de doble cara en espaciadores Mylar. Corte con láser como se describe en el manuscrito al vidrio de la cubierta y asegúrese de que los recortes del canal estén alineados con precisión.
Fije un vidrio de cubierta rectangular a la tira adhesiva más inferior. Use los papeles adhesivos pelados para cubrir las porciones de adhesivo aún expuestas. Una vez completado el montaje, aplique una presión firme e igual a la construcción.
Con una jeringa llena de agua desionizada, enjuague el canal. Esterilice la carcasa del canal en un esterilizador ultravioleta durante 30 minutos. Usando una técnica estéril, tratar el canal con solución de fibronectina humana preparada en PBS e incubar durante al menos 30 minutos a 37 grados centígrados.
En la campana de flujo laminar estéril, prepare la suspensión celular NCI H441 utilizando medio RPMI 1640 con 10% FBS. Use 0.25 mililitros de esta suspensión celular para llenar el canal y una porción de los puertos. Usando microscopía de campo claro, verifique que las células se hayan distribuido uniformemente dentro de los canales.
Agregue el depósito de medios y la llave de paso al canal. Comience a cultivar el canal a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Use una bomba de jeringa programable para extraer los medios gastados del canal y los medios frescos en el canal desde un depósito de medios estériles conectado a la entrada del canal.
En una campana extractora de humos químicos, diluya una solución de formaldehído al 4% en DPBS para crear una solución al 1% y guárdela en un tubo debidamente etiquetado. Prepare la solución de formaldehído al 2% de manera similar. Transfiera las soluciones de formaldehído a jeringas de cinco mililitros debidamente etiquetadas.
Extraiga 20 mililitros de DPBS en una jeringa separada de 20 mililitros que se utilizará para los pasos de lavado. A continuación, retire el canal microfluídico del aparato de cultivo y asegúrelo en la campana de humos químicos. Para ensamblar el aparato de fijación y tinción, conecte un segmento de tubo de transferencia al puerto lateral de una llave de paso de tres vías a través de un adaptador de púa de manguera de bloqueo Luer macho.
A continuación, conecte la llave de paso al puerto de entrada de la matriz de flujo. Conecte otro segmento de tubo de transferencia al puerto de salida de la llave de paso existente utilizando el mismo tipo de adaptador de púa de manguera. Finalmente, asegure los extremos libres de ambos tubos de transferencia ahora designados como líneas de desechos en un contenedor de desechos apropiado para riesgos químicos y biológicos.
Asegúrese de que la llave de paso esté bloqueando el puerto de entrada de la matriz de flujo y enjuague la línea de residuos con DPBS. Luego gire la llave de paso para bloquear la línea de desechos y lave lentamente las celdas con dos mililitros de DPBS. Empuje lentamente dos mililitros de fijador al 1% a través del canal.
Déjalo reposar durante cinco minutos y repite con un 2% de fijador. Luego lave las células tres veces con DPBS fresco como se demostró anteriormente. Prepare la solución de saponina al 0,1% como se describe en el manuscrito.
Extraiga DPBS adicionales en una jeringa de 20 mililitros para usar en los pasos de lavado. Cubra el tubo con papel de aluminio. Agregue el reactivo filamentoso de faloidina para tinción de actina y un reactivo Hoechst para teñir núcleos a la solución de saponina al 0,1%.
Luego transfiera la solución a una jeringa cubierta de aluminio. Enjuague la línea de residuos con una pequeña cantidad de solución permeabilizante y de tinción. Luego introduzca dos mililitros de la solución en el canal microfluídico.
Cubra el canal con papel de aluminio para bloquear la luz. Después de 30 minutos, enjuague la solución permeabilizante con dos mililitros de DPBS dos veces durante cinco minutos cada una antes de secar suavemente el canal. Usando una micropipeta, introduzca una cantidad mínima de un montante anti-decoloración suave en el canal microfluídico asegurándose de cubrir completamente la superficie inferior.
Luego selle el extremo del canal. Usando un microscopio de campo claro, verifique rápidamente la integridad de la capa celular antes de almacenar el canal en un recipiente para protegerlo de la luz. Pruebe las ubicaciones de imágenes tomando escaneos de referencia y pilas z hasta que se hayan cumplido los parámetros y condiciones de imagen deseados.
Usando la placa base de la matriz de flujo como referencia, construya pilas z en varias ubicaciones a lo largo de la longitud del canal. Finalmente, analice datos transversales, datos de mapas de profundidad y cualquier otra característica relevante para evaluar las propiedades de la capa celular. El uso exitoso de la técnica se demuestra en el entorno de cultivo dinámico microfluídico a través de la adquisición de imágenes al menos a un centímetro de distancia de la entrada y la salida.
En un experimento representativo de duración del cultivo, se observó una producción exitosa de monocapa cuando las células se cultivaron durante 24 horas. Sin embargo, cuando se cultivó durante 48 horas, se observó formación multicapa indeseable. Los datos recopilados de cada una de las cinco ubicaciones de imágenes de canales microfluídicos también revelan la relación entre el aumento de la duración del cultivo y el aumento del área de la sección transversal, lo que sugiere que la formación desigual de capas o el crecimiento excesivo ocurren dentro de las 48 horas posteriores al cultivo.
Se obtuvo el mapa de profundidad de una ubicación central dentro del canal microfluídico cultivado durante 24 horas, que es útil para la evaluación cualitativa de las características de la capa. Los tres aspectos más cruciales de este protocolo son la construcción adecuada del canal, las condiciones precisas de cultivo y flujo de medios, y el uso cuidadoso del aparato de fijación y tinción. Después de este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos en paralelo para validar la viabilidad experimental de las monocapas celulares producidas, como la detección de impedancia celular y sustrato eléctrico, ECIS, o la resistencia eléctrica transepitelial, TEER.
