يصف هذا البروتوكول كيفية تحفيز الالتهام الذاتي في جسم الدهون اليرقية ذبابة الفاكهة عن طريق استنفاد الأحماض الأمينية وكيفية تحليل الاختلافات في الالتهام الذاتي بين الحيوانات المستنسخة الطافرة. نظرا لأن الالتهام الذاتي حساس للغاية لتوافر التغذية في ظروف الاستزراع ، فإن التحليل النسيلي ، وهو طريقة تحلل الخلايا الطافرة مقابل الخلايا البرية في نفس النسيج ، له ميزة في تشريح عيوب الالتهام الذاتي. ابدأ بإدخال ثلاثة ذكور و 15 أنثى ذباب بالغة في قارورة استزراع مع دقيق الذرة القياسي أو دبس السكر أو أجار ذبابة الفاكهة الوسطى عند 25 درجة مئوية للتزاوج.
في 48 ساعة بعد الحث ، اضغط على قارورة التزاوج حتى يذهل الذباب ويسقط على الوسائط في قاعدة القارورة. افصل قارورة التزاوج وقم بتغطية فمها بقارورة ثقافة مقلوبة غير موصولة بوسائط جديدة. ثم اقلب القوارير واضغط عليها لنقل الذباب إلى قارورة الثقافة الطازجة.
قم بتوصيل قارورة الثقافة الطازجة وتخلص من القارورة القديمة. ضع قارورة الثقافة الطازجة في حاضنة 25 درجة مئوية لوضع البيض على الوسائط الطازجة. قم بإزالة الذباب بعد ست ساعات من وضع البيض وتخلص من الذباب عن طريق إلقائه في دورق يحتوي على 75٪ من الإيثانول.
احتضان القارورة مع الأجنة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للحث على التعبير عن الخفقان. بعد ذلك ، ضعها في حاضنة 25 درجة مئوية واسمح للأجنة بالاستمرار في التطور. باستخدام ملعقة مختبرية ، استخرج الوسائط التي تحتوي على اليرقات النامية في طبق بتري بعد 75 ساعة من وضع البيض.
أضف 1X PBS إلى الطبق وافصل برفق وسائط الاستزراع واليرقات باستخدام ملقط طويل. ثم حدد 10 إلى 15 يرقة ثالثة مبكرة. املأ آبار صفيحة بقعة منخفضة زجاجية مكونة من تسعة آبار ب 1X PBS وضع اليرقات الثالثة المنفصلة في الآبار باستخدام ملقط طويل.
اغسل اليرقات جيدا لإزالة جميع بقايا الوسائط. خذ خمسة ملليلتر من محلول السكروز 20٪ في قنينة فارغة وضع يرقات الطور الثالثة النظيفة في هذا المحلول باستخدام ملقط طويل. احتضان هذه القارورة في حاضنة 25 درجة مئوية لمدة ست ساعات قبل حصادها للتشريح.
أضف 1X PBS إلى كل بئر من الصفيحة الموضعية للانخفاض الزجاجية ذات التسعة آبار وانقل اليرقات إلى الآبار باستخدام ملقط طويل. ضع يرقة واحدة في بئر بحيث يكون الجانب الظهري متجها لأعلى. امسك بشرة اليرقة بملقطين 5 في منتصف جذع اليرقات وافتح البشرة برفق.
ستظل الأجسام الدهنية المكشوفة ، إلى جانب الأنسجة الداخلية لليرقات الأخرى ، متصلة بجثة اليرقة. سحب ما يكفي لفضح الأعضاء الداخلية قدر الإمكان. كرر هذه الخطوة لجميع اليرقات.
نقل جثة اليرقات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 500 ميكرولتر من 4٪ PFA واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية دون هز الأنابيب. بعد 30 دقيقة ، قم بإخراج محلول PFA. أضف 500 ميكرولتر من 1X PBS في الأنبوب.
هز الأنبوب برفق على دوار مسطح لمدة 10 دقائق ثم تخلص من محلول 1X PBS. كرر هذا ثلاث مرات. باستخدام ملقط طويل ، انقل جثة اليرقات الثابتة والمغسولة إلى بئر في لوحة بقعة الاكتئاب التسعة المملوءة ب 1X PBS.
إزالة جميع أنسجة الجسم غير الدهنية مع 5 ملقط. أخيرا ، قم بتركيب قطع الجسم الدهني على شريحة مجهرية باستخدام 80٪ من الجلسرين كوسيط تثبيت ووضع غطاء في الأعلى. الطافر واحد والثاني المتحور هما متحولان قاتلان مستقلان على الكروموسوم X والذباب الأبيض الأصفر المنشأ FRT 19A بمثابة عنصر تحكم هنا.
تم تحليل أنماط GFP-Atg8a في الجسم الضابط ، أو الطافر ، أو اثنين من أجسام الدهون اليرقية الفسيفسائية الطافرة ، وتم تمييز الحيوانات المستنسخة الطافرة أو الحيوانات المستنسخة الضابطة سلبا بواسطة RFP. في الحيوانات المستنسخة الضابطة ، كانت أنماط GFP-Atg8a Puncta مشابهة لتلك الموجودة في الخلايا الإيجابية RFP المحيطة. في الحيوانات المستنسخة المتحولة ، تم تقليل GFP-Atg8a Puncta بشكل كبير.
وفي اثنين من الحيوانات المستنسخة الطافرة الطافرة ، تم زيادة أعداد وحجم GFP-Atg8a Puncta. مرحلة نمو اليرقات أمر بالغ الأهمية هنا. يجب تعديل وقت التطوير ومدة المجاعة وفقا لوصفات وسط الاستزراع في كل مختبر.
يمكن تطبيق هذا الإجراء لاستكشاف الالتهام الذاتي الانتقائي. على سبيل المثال ، يمكن مراقبة الميتوفاجي في أجسام الدهون الذبابة عن طريق ربط بروتين الفلورسنت بتسلسل استهداف الميتوكوندريا.
