الالتهاب العصبي هو لاعب رئيسي في الاضطرابات العصبية المختلفة. وبالتالي ، من الأهمية بمكان البحث وتطوير نماذج بديلة للالتهابات العصبية في الجسم الحي لتسهيل دراسات التطور المرضي. التقنية الموصوفة هنا هي أداة ممتازة لفهم التغيرات المرضية في الدماغ بشكل أفضل عن طريق التصوير في الجسم الحي ، ولتقييم الأدوية المضادة للالتهابات العصبية المحتملة بسرعة وكفاءة.
استعد للحقن عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجتذب micropipette باتباع بروتوكول الخطوات الخمس لسحب الأنبوب الشعري الزجاجي. افتح طرف الإبرة إلى الحجم المناسب بزاوية باستخدام الملقط. املأ الإبرة ب 0.1 ملليلتر من الزيت المعدني لضمان عدم وجود فقاعات.
قم بإزالة الغطاء اللولبي للإبرة الفولاذية لجهاز الحقن المجهري. قم بمحاذاة فتحة الإبرة الزجاجية مع الإبرة الفولاذية ، ثم شد الغطاء اللولبي. قم بتركيب جهاز الحقن المجهري للإبرة المحملة في مناور دقيق.
اضبط موضع جهاز الحقن المجهري بحيث يمكن للمناور الدقيق تحريك الجهاز بمرونة تحت المجهر. تفريغ كمية مناسبة من زيت البارافين اللازمة لجعل الإبرة الفولاذية تدخل الأنبوب الزجاجي الشعري. قم بإسقاط محلول الحقن الذي يتكون من PBS أو عديد السكاريد الدهني على شريحة زجاجية معقمة بنسبة 70٪ من الإيثانول واضبط جهاز الحقن الدقيق بحيث يتم إدخال الطرف في قطرة السائل.
قم بتحميل ما يقرب من ميكرولتر من محلول الحقن في الإبرة. قم بإعداد micromanipulator بحيث يكون طرف إبرة جهاز الحقن الدقيق في نفس مجال الرؤية مثل اليرقات عند التكبير العالي. تذوب محلول 2٪ من الأغاروز في الماء المقطر المزدوج باستخدام الميكروويف.
صب الأغاروز المنصهر في طبق بلاستيكي. استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل اليرقات المخدرة إلى وسط طبق بلاستيكي مغطى بالأغاروز بنسبة 2٪. قم بتوجيه اليرقات المركبة بحيث يكون جانب الدماغ لأعلى للوصول إلى الإبرة.
اضبط تكبير المجهر بحيث يتم عرض بنية البطين الدماغي للزرد بوضوح في مجال الرؤية. ضع الإبرة بعناية فوق غسق الدماغ. قم بتنظيف منطقة الدماغ باستخدام 70٪ من الإيثانول وثقب جلد دماغ الزرد بطرف الإبرة ببطء باستخدام المناور الدقيق.
اضغط على دواسة القدم لإخراج نانولتر واحد من 1X PBS أو تركيزات مختلفة من عديد السكاريد الدهني. نقل اليرقات إلى وسط E3 نظيفة مباشرة بعد الحقن. بعد 24 ساعة ، اجمع اليرقات للتصوير المجهري ، والفحص السلوكي للقاطرة ، وتحديد المؤشرات الأخرى.
تحضير محلول أغاروز منخفض الذوبان بنسبة 1.5٪ في وسط E3 وتسخينه في الميكروويف لتشكيل سائل صاف. استخدم ماصة نقل بلاستيكية نظيفة لنقل اليرقات إلى شريحة زجاجية وإزالة أكبر قدر ممكن من الماء. استخدم ماصة نقل بلاستيكية لإضافة قطرة من 1.5٪ من الأغاروز منخفض الذوبان إلى اليرقات.
استخدم إبرة حقنة ملليلتر واحد لتوجيه اليرقات. انتظر حتى يبرد الأغاروز ويتصلب قبل بدء التصوير. بعد 24 ساعة من حقن البطين الدماغي عديد السكاريد الشحمي، تابع تحديد علامات التعبير الجيني.
استخدم حقنتين سعة ملليلتر واحد لفصل أجزاء الرأس من اليرقات بدون مناطق كيس العين وصفار البيض. تجانس جزء الرأس مع 200 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مطحنة الأنسجة في 11،000 دورة في الدقيقة لمدة خمس ثوان ، ثم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة الكلوروفورم الأيزوبروبانول. جفف حبيبات الحمض النووي الريبي في الهواء لمدة خمس إلى 10 دقائق ، ثم أضف 30 ميكرولترا من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي لإذابة حبيبات الحمض النووي الريبي.
توليف cDNA باستخدام النسخ العكسي مع البادئات العشوائية كما هو موضح في مخطوطة النص. بعد ذلك ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي على نظام qPCR باستخدام مجموعة RT-qPCR المتاحة تجاريا لتحديد التعبير عن الجينات المستهدفة. بعد 24 ساعة من حقن البطين الدماغي عديد السكاريد الشحمي ، انقل يرقات الزرد إلى آبار صفيحة دقيقة مربعة مكونة من 96 بئرا بشكل فردي.
أضف 300 ميكرولتر من وسط E3 إلى كل بئر ثم احتضن اليرقات لمدة أربع ساعات لتتأقلم مع لوحة الاختبار. نقل الصفيحة الدقيقة المحملة باليرقات إلى صندوق تتبع الزرد. قم بتشغيل مصدر الضوء واحتضان اليرقات في مربع الاختبار لمدة 30 دقيقة للتأقلم مع البيئة.
مراقبة وتسجيل سلوك الزرد باستخدام نظام تتبع الفيديو الآلي. سجل 12 جلسة مدة كل منها خمس دقائق ليرقات الزرد الفردية وحدد المسافة الإجمالية كما هو موضح في مخطوطة النص. بعد العلاج لمدة 24 ساعة ، تسبب واحد إلى خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من حقن الدماغ البطيني عديد السكاريد الشحمي في فقدان كبير للخلايا العصبية RA في دماغ TgEtvmat2: GFP اليرقات الزرد مقارنة مع المجموعات الضابطة والوهمية.
أظهر الخط المعدل وراثيا elavl3: mCherry zebrafish تغيرات كبيرة في الكثافة المتكاملة الفلورية للخلايا العصبية في الدماغ اليرقية عند حقنها ب 2.5 إلى خمسة ملليغرام لكل ملليلتر عديد السكاريد الدهني ، في حين أن ملليغرام واحد لكل ملليلتر حقن عديد السكاريد الدهني لم يظهر أي تأثير. علاوة على ذلك ، تسببت خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من عديد السكاريد الدهني في نقص الحركة وتقليل المسافة الإجمالية لحركة الزرد خلال فترة تتبع مدتها 60 دقيقة. تم زيادة إنتاج أكسيد النيتروز وتعبير mRNA للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات في رأس يرقات الزرد على 2.5 إلى خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من العلاج عديد السكاريد الدهني مقارنة بالتعبير في المجموعات الضابطة والوهمية.
أظهر حقن واحد إلى خمسة ملليغرام لكل ملليلتر عديد السكاريد الشحمي تجنيد العدلات في دماغ الزرد اليرقات ، مما أدى إلى زيادة كبيرة في عدد العدلات في منطقة دماغ الزرد Tgmpo: eGFP. يعد حجم فتحة الإبر ومقدار قوة الحقن للحقن المجهري جنبا إلى جنب مع فصل الرأس عن عيني وجسم الزرد أمرا بالغ الأهمية لهذا الإجراء.
