Нейровоспаление является ключевым игроком в различных неврологических расстройствах. Следовательно, он представляет большой интерес для исследования и разработки альтернативных моделей нейровоспаления in vivo для облегчения исследований патологического развития. Метод, описанный здесь, является отличным инструментом для лучшего понимания патологических изменений в головном мозге с помощью визуализации in vivo, а также для быстрой и эффективной оценки возможных противоневровоспалительных препаратов.
Подготовьтесь к инъекции, вытягивая стеклянные капилляры с помощью съемника микропипетки в соответствии с пятиступенчатым протоколом для вытягивания стеклянной капиллярной трубки. Откройте кончик иглы до соответствующего размера под углом с помощью щипцов. Наполните иглу 0,1 миллилитрами минерального масла, чтобы убедиться, что пузырьков нет.
Снимите винтовой колпачок стальной иглы микроинъекционного аппарата. Совместите отверстие стеклянной иглы со стальной иглой, затем затяните крышку винта. Установите нагруженный игольчатый микроинъекционный аппарат в микроманипулятор.
Отрегулируйте положение микроинъекционного аппарата так, чтобы микроманипулятор мог гибко перемещать аппарат под микроскопом. Выгрузите соответствующий объем парафинового масла, необходимый для того, чтобы стальная игла попала в капиллярную стеклянную трубку. Опустите раствор для инъекций, состоящий из PBS или липополисахарида, на стеклянную горку, стерилизованную 70% этанолом, и отрегулируйте микроинъекционный аппарат так, чтобы наконечник был вставлен в каплю жидкости.
Загрузите примерно два микролитра инъекционного раствора в иглу. Настройте микроманипулятор так, чтобы кончик иглы микроинъекционного аппарата находился в том же поле зрения, что и личинки на большом увеличении. Растопить раствор 2% агарозы в двойной дистиллированной воде с помощью микроволновой печи.
Перелейте расплавленную агарозу в пластиковую посуду. Используйте пластиковую передаточную пипетку для транспортировки обезболенных личинок к центру пластиковой посуды с 2%-ным покрытием из агарозы. Ориентируйте конных личинок головной стороной вверх для доступа иглы.
Отрегулируйте увеличение микроскопа так, чтобы желудочковая структура мозга рыбок данио четко отображалась в поле зрения. Осторожно поместите иглу над тектумом мозга. Очистите область мозга 70% этанолом и медленно проколите кожу мозга рыбки данио кончиком иглы с помощью микроманипулятора.
Нажмите ножную педаль, чтобы извлечь один нанолитр 1X PBS или различных концентраций липополисахарида. Перенесите личинок в чистую среду Е3 сразу после инъекции. Через 24 часа соберите личинок для микроскопической визуализации, поведенческого анализа локомотивов и определения других показателей.
Приготовьте 1,5% раствор агарозы с низким расплавом в среде E3 и нагрейте его в микроволновой печи с образованием прозрачной жидкости. Используйте чистую пластиковую передаточную пипетку, чтобы транспортировать личинок на стеклянную горку и удалить как можно больше воды. Используйте пластиковую переносную пипетку, чтобы добавить каплю 1,5% агарозы с низким расплавом в личинки.
Используйте иглу для шприца в один миллилитр, чтобы сориентировать личинок. Подождите, пока агароза остынет и затвердеет, прежде чем начинать визуализацию. Через 24 часа после инъекции липополисахарида желудочков в мозг приступают к определению маркеров экспрессии генов.
Используйте два одномиллилитрных шприца, чтобы отделить головные части личинок без областей глаз и желточного мешка. Гомогенизируйте головную часть 200 микролитрами реагента для экстракции РНК с помощью тканевой шлифовальной машины со скоростью 11 000 оборотов в минуту в течение пяти секунд, затем выполните экстракцию РНК с использованием метода изопропанола хлороформа. Высушите гранулу РНК на воздухе в течение пяти-10 минут, затем добавьте 30 микролитров воды без РНК для растворения гранулы РНК.
Синтезируйте кДНК с помощью обратной транскриптазы со случайными праймерами, как описано в рукописи текста. Затем выполните ПЦР в режиме реального времени в системе qPCR с использованием коммерчески доступного набора RT-qPCR для определения экспрессии генов-мишеней. Через 24 часа после инъекции липополисахарида желудочков в мозг перенесите личинок рыбок данио в колодцы 96-луночной квадратной микропластины по отдельности.
Добавьте 300 микролитров среды E3 в каждую лунку, а затем инкубируйте личинки в течение четырех часов, чтобы акклиматизироваться к тестовой пластине. Перенесите загруженную личинками микропластинку в ящик для отслеживания рыбок данио. Включите источник света и высиживайте личинок в испытательной коробке в течение 30 минут, чтобы акклиматизироваться к окружающей среде.
Отслеживайте и записывайте поведение рыбок данио с помощью автоматизированной системы видеослежения. Запишите 12 сеансов по пять минут каждый для отдельных личинок рыбок данио и определите общее расстояние, как описано в рукописи текста. После лечения в течение 24 часов от одного до пяти миллиграммов на миллилитр липополисахарида желудочковой инъекции мозга вызывали значительную потерю нейронов РА в мозге TgEtvmat2: GFP личинок рыбок данио по сравнению с контрольной и фиктивной группами.
Трансгенная линия elavl3:m Вишня рыбки данио продемонстрировала значительные изменения в интегральной плотности флуоресценции личиночных нейронов мозга при введении от 2,5 до пяти миллиграммов на миллилитр липополисахарида, в то время как инъекция одного миллиграмма на миллилитр липополисахарида не показала никакого эффекта. Кроме того, пять миллиграммов на миллилитр липополисахарида вызывали дефицит локомоции и уменьшали общее расстояние движения рыбок данио в течение 60-минутного периода отслеживания. Производство закиси азота и экспрессия мРНК провоспалительных цитокинов в голове личинок рыбок данио были увеличены на 2,5-пять миллиграммов на миллилитр липополисахарида по сравнению с экспрессией в контрольной и фиктивной группах.
Инъекция от одного до пяти миллиграммов на миллилитр липополисахарида продемонстрировала набор нейтрофилов в мозг личинок рыбок данио, что привело к значительному увеличению числа нейтрофилов в области мозга рыбок данио Tgmpo: eGFP. Размер отверстия игл и количество силы инъекции для микроинъекции вместе с отделением головы от глаз и тела рыбок данио имеет решающее значение для этой процедуры.
