هذا البروتوكول مهم لأنه يمكن الباحثين من إنضاج hiPSC-CMs التجارية أو المصنوعة داخليا إلى نمط ظاهري يشبه البالغين يحسن بشكل كبير القيمة التنبؤية ل hiPSC-CMs في فحص السمية القلبية. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يوفر hiPSC-CMs ناضجة بتنسيق عالي الإنتاجية لرسم الخرائط البصرية للكالسيوم أو تغيير الجهد. يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في آليات المرض أو لفحص الأدوية بحثا عن السمية القلبية.
سيوضح الإجراء جيفري كريش ، وهو باحث مشارك من مختبري. ابدأ بغسل المصفوفة خارج الخلية التي تحفز النضج ، أو MECM ، مرتين مع 200 ميكرولتر من محلول الملح المتوازن من هانك ، أو HBSS ، قبل 1 ساعة من طلاء عضلة القلب. حافظ على رطوبة الآبار.
انقل أنابيب عضلة القلب من خزان النيتروجين السائل إلى الثلج الجاف ، وحرر الضغط عن طريق فتح أغطية الأنبوب قليلا. بعد ذلك ، أعد إغلاق أغطية الأنبوب وقم بإذابتها في حمام مائي لمدة 4 دقائق. بعد ذوبان الخلايا ، قم برش الأنابيب بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل فتحها.
نقل الخلايا إلى أنابيب مخروطية 15 ملليلتر مع ماصة 1 ملليلتر. أضف 1 ملليلتر من وسط الطلاء إلى cryovial وانقل الغسيل إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 ملليلتر. ثم ، بالتنقيط ببطء 1 ملليلتر من وسط الطلاء وتحريك الأنبوب.
كرر هذا حتى نقل 8 ملليلتر من وسط الطلاء. أجهزة الطرد المركزي أنبوب 15 ملليلتر في 300 × غرام لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق بيليه في 1 ملليلتر من وسط الطلاء. قم بإزالة القسمة ، وقم بإجراء عد الخلايا الحية باستخدام مقياس الدم قبل إضافة وسيط طلاء للحصول على 7.5 × 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر.
الاستغناء عن 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر من لوحة 96 بئر المغلفة MECM باستخدام ماصة متعددة القنوات ، واحتضان الخلايا لمدة 2 أيام. بعد ذلك ، استبدل الوسيط ب 200 ميكرولتر من وسيط الصيانة ، وحافظ على الألواح لمدة 7 أيام ، مع تغيير الوسيط في اليوم 5. في اليوم 7 ، قم بإجراء فحص EP ، كما هو موضح في النص.
تأكد من تغيير الوسيط كل يوم عند اختيار توسيع ثقافة الخلية. لتنقية hiPSC-CM عن طريق فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا ، أو MACS ، قم بشفط وسط زراعة الخلايا وغسل الخلايا ب 1 ملليلتر من HBSS-ثم ، قم بفصل الخلايا عن طريق إضافة 1 ملليلتر من 0.25٪ تربسين-إيثيلين ديامينيترايتيك ، أو EDTA ، واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق. ثم قم بتعطيل التربسين / EDTA عن طريق إعادة إرسال الخلايا وتفردها ب 2 ملليلتر من وسط الطلاء.
من الآبار الستة ، اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر باستخدام مصفاة 70 ميكرومتر. بعد غسل المصفاة ب 3 ملليلتر من وسط الطلاء ، عد الخلايا. بعد العد ، قم بالطرد المركزي وغسل حبيبات الخلية ب 2 ملليلتر من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد قبل التكوير وإعادة إرسال الخلايا في 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد لكل 5 × 10 إلى الخلايا السادسة.
أضف 20 ميكرولترا من كوكتيل استنفاد الخلايا العضلية الباردة غير القلبية واخلط التعليق قبل الحضانة على الجليد لمدة 10 دقائق. بعد غسل الخلايا ب 4 ملليلتر من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، أعد تعليق الحبيبات في 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد. أضف 20 ميكرولترا من الميكروبيدات الباردة المضادة للبيوتين لكل 5 × 10 إلى الخلايا السادسة ، وامزج تعليق الخلية برفق قبل الحضانة على الجليد لمدة 10 دقائق.
أثناء احتضان العينات ، ضع أعمدة الاستنفاد الموجبة المزودة بمرشحات ما قبل الفصل 30 ميكرومتر على فاصل MACS ، وضع أنابيب التجميع الموسومة 15 ملليلتر أسفل الأعمدة. بعد ذلك ، قم بتجهيز كل عمود ب 3 ملليلتر من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد. امزج معلق الخلية المعالج بالأجسام المضادة مع 2 ملليلتر من المخزن المؤقت لفصل MACS وأضفه إلى العمود.
أضف 2 ملليلتر من المخزن المؤقت لفصل MACS إلى كل عمود واجمع 12 ملليلتر من تعليق خلايا عضلة القلب المتدفقة. الطرد المركزي للخلايا العضلية القلبية وتجاهل المادة الطافية قبل تعليق خلايا عضلة القلب في وسط طلاء 1 ملليلتر. لتحديد التركيز ، عد الخلايا واضبط الحجم على كثافة البذر المطلوبة قبل طلاء خلايا عضلة القلب المنقاة على ألواح MECM 96-well.
نضح واستبدل وسط صيانة خلايا عضلة القلب ب 100 ميكرولتر من الأصباغ الحساسة للجهد ، أو VSD ، أو الفلوروفورات الحساسة للكالسيوم ، أو CSF ، لكل بئر من صفيحة 96 بئرا. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، استبدل الأصباغ بوسيط فحص أو HBSS. قم بموازنة الخلايا عند 37 درجة مئوية قبل الحصول على رسم الخرائط الضوئية لبيانات خط الأساس باستخدام جهاز رسم خرائط بصري عالي الإنتاجية.
لعلاج الخلايا بالأدوية لاختبار التعرض الحاد أو رسم خريطة للخلايا المعرضة بشكل مزمن للعقاقير ذات الأهمية ، قم بتخفيف الأدوية في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، أو DMSO ، وتخزينها كمحاليل مخزون عند 20 درجة مئوية قبل تخفيفها في HBSS إلى التركيزات المطلوبة. لاختبار السمية القلبية في 96 لوحة بئر ، أضف أربع جرعات من مركب يحتوي على ثمانية آبار على الأقل لكل جرعة. استخدم جرعات تتراوح من أقل إلى أعلى من تركيز البلازما العلاجية الفعالة سريريا ، بما في ذلك الجرعة الفعالة.
على غرار قياسات الفيزيولوجيا الكهربية الأساسية قبل تطبيق الدواء ، التقط تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية بعد 30 دقيقة على الأقل من العلاج الدوائي للدراسات المزمنة. بعد التسجيلات الأساسية ، ضع أربع جرعات على الأقل من كل دواء على طبقات أحادية hiPSC-CMs الناضجة التي تعبر عن GCaMP6m ، مع ثمانية آبار على الأقل لكل جرعة. قم بموازنة الأدوية على الخلايا لمدة 30 دقيقة ، وقم بتسخين الخلايا إلى 37 درجة مئوية قبل وأثناء الحصول على البيانات.
بعد التسجيلات الأساسية للوحة بأكملها ، أضف 500 نانومولار إيزوبروتيرينول إلى كل بئر لتمكين بيانات استجابة قوية للأدوية وتحديد آثار الأيزوبروتيرينول على معدل ضربات أحادي الطبقة ، وسعة الانكماش ، ومدة الكالسيوم العابرة. للحصول على بيانات الخرائط الضوئية ، افتح الدرج الأمامي وضع اللوحة على سخان اللوحة. بعد فتح برنامج الاستحواذ وتحديد موقع حفظ الملف في البرنامج ، حدد مدة 10 إلى 30 ثانية ومعدل الإطارات للاكتساب للحصول على دقة زمنية أعلى ، وانقر فوق بدء الاستحواذ.
افتح برنامج التحليل، وفي علامة التبويب استيراد عامل تصفية، حدد إما الاستعراض بحثا عن ملف واحد أو تجانب متعدد لإعادة إنشاء لوحة. حدد الملفات وأدخل عددا من الصفوف والأعمدة وحدد تلقائي. بعد ذلك ، حدد تحديث حجم البكسل ، وأدخل المسافة لكل بكسل ، واستخدم معالج البئر لتحديد موقع الآبار في الصورة قبل النقر فوق عملية حفظ والانتقال إلى علامة التبويب التالية.
افتح علامة التبويب عائد الاستثمار ، أو مناطق الاهتمام ، واختر رسم عائد الاستثمار يدويا أو تلقائيا أو عدم استخدام عائد الاستثمار على الإطلاق ، والذي سيتم أخذه في الاعتبار لتحليل اللوحة بأكملها. بعد تحديد المنطقة في البئر ، انقر فوق حفظ العملية زر للانتقال إلى الخطوة التالية. حدد مربعات إخفاء الآبار وإظهار المربعات التي تمت تصفيتها فقط لتصور عائد الاستثمار.
افتح علامة التبويب التحليل ، وحدد كل بئر أو عائد استثمار لتأكيد دقة الكشف التلقائي عن النبض. قم بإضافة أو إزالة النبضات من الآثار عن طريق تحديد إيقاع فردي والضغط على حذف على لوحة المفاتيح. بمجرد الانتهاء ، انقر فوق حفظ.
بعد ذلك ، انقر فوق الزر Time-Space Plot في علامة التبويب Analysis وأضف السطر لتحديد مخطط الزمان والمكان لتصور البيانات لكل بئر أو عائد الاستثمار. بعد تحديد خط أفقي أو رأسي ، انقر فوق إنشاء مؤامرة. بعد التأكد من الكشف الدقيق عن الإيقاع ، انتقل إلى تصدير علامة التبويب وحدد تنسيق الملف ، أدخل خيار Beat Statistic قبل النقر فوق تصدير.
بمجرد التصدير ، افتح ملفات البيانات وقم بتشغيل روتين التحليل الإحصائي المختار. أظهر تصوير تباين الطور أن hiPSC-CMs المطلية على MECM قد نضجت وأصبحت متميزة هيكليا عن نفس المجموعة من hiPSC-CMs المعاد طلاؤها على الماوس ECM. أصبحت الخلايا الناضجة على شكل قضيب ، بينما احتفظت الخلايا غير الناضجة بشكل دائري.
أظهرت خلايا عضلة القلب الملطخة بالأجسام المضادة ألفا أكتينين الشكل النموذجي للخلايا المزروعة في كل حالة ECM. تمشيا مع تلطيخ TnI ، أشار تلطيخ ألفا أكتينين إلى أن hiPSC-CMs الناضجة على MECM عززت النمط الظاهري الناضج على شكل قضيب وحفزت تنظيما أكبر للقطعة العضلية. كان محتوى الميتوكوندريا ونشاطها متميزين بين الخلايا المزروعة على ECM للفأر و MECM.
أظهرت البيانات الفيزيولوجية الكهربية لجهود الفعل المسجلة باستخدام VSDs ونظام رسم الخرائط الضوئية أن الخلايا الخاصة بالأذين لها معدل ضربات تلقائي أسرع بكثير ومدة جهد عمل أقصر ، أو APD80 ، من الخلايا الخاصة بالبطين. كشفت الخرائط الحرارية للوحة الكاملة لمعلمات مثل APD80 عن قابلية استنساخ معلمة معينة داخل اللوحة. أشارت إمكانات العمل النموذجية للطبقات الأحادية hiPSC-CM الناضجة إلى مورفولوجيا جهد العمل لخلايا عضلة القلب البالغة المعزولة والمختبرة.
كما تم عرض إيقاع عفوي محتمل نموذجي. استجابة للأيزوبروتيرينول ، تسبب تنشيط مستقبلات بيتا 1 الأدرينالية في كرونوتروبي إيجابي ، مؤثر في التقلص العضلي الإيجابي ، و lusitropy الإيجابي. تمت دراسة استجابة HiPSC-CM للجين البشري المرتبط بالأثير ، أو hERG ، مانع القناة ، بما في ذلك E-4031 ، ودومبيريدون ، وفاندتانيب ، وسوتالول ، باستخدام مضان الكالسيوم GCaMP6m لمراقبة الإيقاع.
أظهرت الدراسة الكشف المبكر عن إزالة الاستقطاب بعد حصار قناة E-4031 hERG. اعمل بسرعة مع الخلايا المعلقة وتجنب إجهاد القص عن طريق سحب الخلايا برفق. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإجراء تغيير الوسائط بعناية لتجنب إتلاف الخلايا المخلوية hiPS.
بعد هذا الإجراء ، تكون الخلايا قابلة للبروتين والحمض النووي الريبي والحمض النووي وجمع الدهون للتحليل باستخدام التقنية المفضلة للباحثين. تمكن هذه التقنية الباحثين من التحقيق في الأمراض واختبار السمية القلبية للعقاقير الجديدة باستخدام خلايا عضلية قلبية تشبه البالغين.
