Este protocolo es significativo porque permite a los investigadores madurar hiPSC-CM comerciales o de fabricación interna a un fenotipo similar al de un adulto que mejora significativamente el valor predictivo de los hiPSC-CM en la detección de cardiotoxicidad. La principal ventaja de este protocolo es que ofrece hiPSC-CM maduros en un formato de alto rendimiento para el mapeo óptico de calcio o cambio de voltaje. Este protocolo se puede utilizar para investigar los mecanismos de la enfermedad o para detectar cardiotoxicidad en los medicamentos.
Demostrando el procedimiento estará Jeffrey Creech, un investigador asociado de mi laboratorio. Comience lavando las placas de la matriz extracelular que induce la maduración, o MECM, dos veces con 200 microlitros de la solución salina balanceada de Hank, o HBSS, 1 hora antes del recubrimiento de cardiomiocitos. Mantenga los pozos hidratados.
Transfiera los tubos de cardiomiocitos del tanque de nitrógeno líquido al hielo seco y libere la presión abriendo ligeramente las tapas del tubo. A continuación, vuelva a sellar las tapas del tubo y descongélelas en el baño de agua durante 4 minutos. Después de la descongelación de las células, rocíe los tubos con etanol al 70% antes de abrirlos.
Transfiera las células a tubos cónicos de 15 mililitros con una pipeta de 1 mililitro. Agregue 1 mililitro de medio de recubrimiento al criovial y transfiera el lavado al tubo cónico de 15 mililitros. Luego, gotee lentamente 1 mililitro de medio de recubrimiento y agite el tubo.
Repita esto hasta la transferencia de 8 mililitros de medio de chapado. Centrifugar el tubo de 15 mililitros a 300 x g durante 5 minutos y volver a suspender el pellet en 1 mililitro del medio de recubrimiento. Retire una alícuota y realice el recuento de células vivas con un hemocitómetro antes de agregar un medio de recubrimiento para obtener 7.5 x 10 a las 5 células por mililitro.
Dispensar 100 microlitros de la suspensión celular por pocillo de una placa de 96 pocillos recubierta con MECM usando una pipeta multicanal e incubar las células durante 2 días. A continuación, sustituya el medio por 200 microlitros de medio de mantenimiento, y mantenga las placas durante 7 días, con un cambio de medio el día 5. El día 7, realice el ensayo de EP, como se describe en el texto.
Asegúrese de cambiar el medio cada dos días cuando opte por extender el cultivo celular. Para purificar hiPSC-CM a través de la clasificación celular activada magnéticamente, o MACS, aspire el medio de cultivo celular y lave las células con 1 mililitro de HBSS-Luego, disocie las células agregando 1 mililitro de 0.25% de tripsina-etilendiaminotetraacético, o EDTA, e incubando las células durante 10 minutos. Luego, inactive la tripsina / EDTA reenviando y singularizando las células con 2 mililitros de medio de recubrimiento.
De los seis pocillos, recolecte las células en un tubo cónico de 50 mililitros usando un colador de 70 micrómetros. Después de lavar el colador con 3 mililitros de medio de recubrimiento, cuente las células. Después de contar, centrifugar y lavar el pellet de celda con 2 mililitros de tampón de separación MACS helado antes de peletizar y reenviar las celdas en 80 microlitros de tampón de separación MACS frío por 5 x 10 a la 6ª celda.
Agregue 20 microlitros de cóctel frío de agotamiento de no cardiomiocitos y mezcle la suspensión antes de incubar en hielo durante 10 minutos. Después de lavar las celdas con 4 mililitros de tampón de separación MACS frío a 300 x g durante 5 minutos, vuelva a suspender el pellet en 80 microlitros de tampón de separación MACS frío. Agregue 20 microlitros de microperlas frías de antibiotina por 5 x 10 a las 6ª células, y mezcle suavemente la suspensión celular antes de incubar en hielo durante 10 minutos.
Mientras las muestras se están incubando, coloque las columnas de agotamiento positivo equipadas con los filtros de preseparación de 30 micrómetros en el separador MACS y coloque los tubos de recolección de 15 mililitros etiquetados debajo de las columnas. A continuación, prepare cada columna con 3 mililitros de tampón de separación MACS frío. Mezcle la suspensión celular tratada con anticuerpos con 2 mililitros de tampón de separación MACS y agréguelo a la columna.
Agregue 2 mililitros de tampón de separación MACS a cada columna y recoja 12 mililitros de suspensión de cardiomiocitos de flujo. Centrifugar los cardiomiocitos y desechar el sobrenadante antes de resuspender los cardiomiocitos en un medio de recubrimiento de 1 mililitro. Para determinar la concentración, cuente las células y ajuste el volumen a la densidad de siembra deseada antes de colocar las células de cardiomiocitos purificadas en las placas de 96 pocillos MECM.
Aspirar y reemplazar el medio de mantenimiento de cardiomiocitos con 100 microlitros de colorantes sensibles al voltaje, o VSD, o fluoróforos sensibles al calcio, o LCR, por pocillo de una placa de 96 pocillos. Después de 30 minutos de incubación, reemplace los tintes con un medio de ensayo o HBSS. Equilibre las celdas a 37 grados centígrados antes de adquirir el mapeo óptico de datos de referencia utilizando un dispositivo de mapeo óptico de alto rendimiento.
Para tratar las células con medicamentos para pruebas de exposición aguda o mapear las células expuestas crónicamente a medicamentos de interés, diluir los medicamentos en dimetilsulfóxido, o DMSO, y almacenarlos como soluciones madre a 20 grados centígrados antes de diluirlos en HBSS a las concentraciones deseadas. Para las pruebas de cardiotoxicidad en placas de 96 pocillos, agregue cuatro dosis de un compuesto con al menos ocho pocillos por dosis. Use dosis que van de abajo a por encima de la concentración plasmática terapéutica clínicamente efectiva, incluida la dosis efectiva.
Similar a las mediciones de electrofisiología de referencia antes de la aplicación del fármaco, capture los registros de electrofisiología al menos 30 minutos después del tratamiento farmacológico para estudios crónicos. Después de los registros basales, aplique al menos cuatro dosis de cada medicamento a monocapas maduras de hiPSC-CMs que expresen GCaMP6m, con al menos ocho pocillos por dosis. Equilibre los medicamentos en las células durante 30 minutos y caliente las células a 37 grados centígrados antes y durante la adquisición de datos.
Después de los registros de referencia de una placa completa, agregue 500 isoproterenol nanomolares a cada pocillo para permitir datos sólidos de respuesta al fármaco y cuantificar los efectos del isoproterenol en la tasa de latido monocapa, la amplitud de contracción y la duración transitoria del calcio. Para adquirir datos de mapeo óptico, abra el cajón frontal y coloque la placa en el calentador de placas. Después de abrir el software de adquisición y determinar la ubicación de guardado del archivo en el software, seleccione de 10 a 30 segundos de duración y velocidad de fotogramas de adquisición para una mayor resolución temporal, y haga clic en Iniciar adquisición.
Abra el software de análisis y, en la pestaña Importar filtro, seleccione Buscar un solo archivo o Mosaico múltiple para reconstruir una placa. Seleccione los archivos e introduzca un número de filas y columnas y seleccione Automático. A continuación, seleccione Actualizar tamaño de píxel, introduzca la distancia por píxel y utilice el Asistente para pozos para determinar la ubicación de los pozos en la imagen antes de hacer clic en Procesar guardar y pasar a la siguiente pestaña.
Abra la pestaña ROIs, o Regiones de interés, y elija dibujar los ROIs manualmente, automáticamente, o no usar ROIs en absoluto, que se considerarán para el análisis de toda la placa. Después de seleccionar la región en el pozo, haga clic en el botón Procesar guardar para pasar al siguiente paso. Marque las casillas Ocultar pozos y Mostrar solo filtros para visualizar los ROI.
Abra la pestaña Análisis, seleccione cada pozo o ROI para confirmar la precisión de la detección automática de latidos. Agregue o elimine ritmos de los seguimientos seleccionando un ritmo individual y presionando Eliminar en el teclado. Una vez hecho esto, haga clic en Guardar.
A continuación, haga clic en el botón Gráfico de tiempo y espacio en la pestaña Análisis y agregue la línea para determinar el gráfico de espacio-tiempo para visualizar los datos de cada pozo o el ROI. Después de seleccionar una línea horizontal o vertical, haga clic en Generar parcela. Después de asegurarse de la detección precisa del ritmo, vaya a la pestaña Exportar y seleccione Formato de archivo, ingrese a la opción Estadística de ritmo antes de hacer clic en Exportar.
Una vez exportado, abra los archivos de datos y ejecute la rutina de análisis estadístico elegida. Las imágenes de contraste de fase mostraron que los hiPSC-CM chapados en el MECM maduraron y se volvieron estructuralmente distintos del mismo lote de hiPSC-CM rechapados en el ECM del ratón. Las células maduras se volvieron en forma de bastón, mientras que las células inmaduras conservaron una forma circular.
Los cardiomiocitos teñidos con anticuerpos alfa-actinina mostraron la forma típica de las células cultivadas en cada condición de ECM. Consistente con la tinción de TnI, la tinción de alfa-actinina indicó que los hiPSC-CM madurados en el MECM promovieron un fenotipo maduro en forma de bastón e indujeron una mayor organización del sarcómero. El contenido mitocondrial y la actividad fueron distintos entre las células cultivadas en la ECM de ratón y el MECM.
Los datos electrofisiológicos para los potenciales de acción registrados utilizando VSD y el sistema de mapeo óptico mostraron que las células específicas de la auricular tienen una frecuencia de latido espontánea significativamente más rápida y una duración del potencial de acción más corta, o APD80, que las células específicas del ventrículo. Los mapas de calor de placa completa para parámetros como APD80 revelaron la reproducibilidad de un parámetro dado dentro de una placa. Los potenciales de acción típicos de las monocapas maduras de hiPSC-CM indicaron la morfología del potencial de acción de los cardiomiocitos adultos aislados y probados.
También se mostró un ritmo espontáneo potencial de acción típico. En respuesta al isoproterenol, la activación de los receptores beta-1-adrenérgicos causó cronotropía positiva, inotropía positiva y lusitropía positiva. La respuesta HiPSC-CM al gen humano relacionado con el éter, o hERG, bloqueador de canales, incluyendo E-4031, domperidona, vandetanib y sotalol, se estudió utilizando la fluorescencia de calcio GCaMP6m para monitorear el ritmo.
El estudio mostró la detección de despolarizaciones tempranas posteriores causadas por el bloqueo del canal hERG E-4031. Trabaje rápidamente con las células en suspensión y evite el esfuerzo cortante pipeteando las células suavemente. Además, realice el cambio de medios con cuidado para evitar dañar la sincitia hiPS.
Después de este procedimiento, las células son susceptibles de recolección de proteínas, ARN, ADN y lípidos para su análisis con la técnica favorita de los investigadores. La técnica permite a los investigadores investigar enfermedades y probar la cardiotoxicidad de nuevos medicamentos utilizando cardiomiocitos similares a los adultos.
