هذا البروتوكول هو تشريح و زراعة أقسام أنسجة القلب لمدة ستة أيام في ظل الظروف الفسيولوجية التي يمكن استخدامها لاختبار سمية القلب الحادة وكذلك فعالية اختبار علاجات فشل القلب. هذا النظام الثقافي لديه القدرة على أن يصبح نموذج الإنسان التنبؤية القوية في الموقع لاختبار سمية القلب الحادة التي تغلق الفجوة بين نتائج الاختبار قبل السريرية والسريرية. إثبات الإجراءات سيكون (تشينغهوي كو) مدير مختبر من مختبرنا
للحصول على شرائح أنسجة قلب الخنزير، أولاً إضافة الجليد إلى حمام حمام النسيج سترة التبريد من هزاز وإضافة حل تيرود إلى الحمام. استخدام جرة بلاستيكية لتر واحد لجمع الجريان السطحي الجليد الذائب من حمام حمام الأنسجة سترة نقل قلب الخنزير إلى صينية تحتوي على لتر واحد من حل القلب الطازجة الباردة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. استخدام مشرط معقمة قابل للسحب لتشريح القلب لعزل البطين الأيسر واستخدام شفرات الحلاقة مستطيلة لقطع البطين الأيسر إلى واحد إلى اثنين مكعبات كتل سنتيمتر.
جانبا كتلة الأنسجة واحد لشرائح ووضع قطع كتلة الأنسجة المتبقية في أنبوب 50 ملليلتر من محلول تيرود الباردة على الجليد. تدليك بلطف كتلة الأنسجة المحجوزة وإضافة واحد إلى اثنين من قطرات من الغراء الأنسجة إلى حامل عينة معدنية من هزاز. عصا قطعة من 4٪ agar كتلة مع مساحة سطحية من ما يقرب من سنتيمتر مربع واحد إلى الغراء وإضافة واحد إلى اثنين من قطرات من الغراء الأنسجة إلى أجار.
نعلق كتلة القلب إلى جانب agar القلب epicardium أسفل مع الأنسجة شقة ضد حامل ممكن ووضع حامل الأنسجة مع كتلة القلب في حمام تشريح من الهزاز. من الأهمية بمكان أن عصا كتلة القلب إلى أجار مع جانب epicardium القلب التي تواجه أسفل على الغراء الأنسجة والتأكد من الأنسجة مسطحة قدر الإمكان. ثم نعلق أنبوب الأكسجين إلى حمام تشريح وعلبة معدنية مليئة حل التيرود ووضع 40 مصافي الخلايا ميكرومتر على علبة معدنية لجمع أقسام أنسجة القلب كما انهم شرائح.
استخدام برنامج التشغيل هزاز لضبط ارتفاع شفرة والعينة بحيث نصل قريب من الجزء العلوي من الأنسجة ولكن تحت عضلات الحليمات والسائل يغطي الأنسجة والشفرة. حدد مسبقا لضبط المكان الذي تبدأ تشريح الأنسجة. اضغط على شريحة لزيادة السرعة واستخدام مقبض لتحريك شفرة نحو حافة الأنسجة.
اضغط على الشريحة مرة أخرى للتوقف والتقدم لإلغاء تنشيط العملية. ثم ضبط المعلمات القطع كما هو مبين واضغط على شريحة لبدء تقطيع الأنسجة. عندما نصل يصل إلى نهاية الأنسجة ولكن قبل أن يضرب نهاية حامل العينة، شريحة الصحافة مرة أخرى لوقف واضغط على العودة للعودة إلى موقف البداية.
عندما تصل الشرائح إلى كامل طولها ويبدو أنها ذات نوعية جيدة، استخدم ماصة باستور البلاستيكية المليئة بمحلول تيرود البارد لجمع الأنسجة بلطف من الحمام باستخدام ملقط ومقص ربيعي لخلع الشريحة من القلب حسب الضرورة. ضع كل شريحة تم جمعها في مصفاة خلية واحدة في حمام التيرود المؤكسج واستخدم الحل في الماصات للضغط على الأنسجة على سطح مصفاة الخلية. ثم ضع غسالة معدنية على الجزء العلوي من الأنسجة للاحتفاظ بها.
بعد ساعة واحدة على الأقل في حل التيرود المؤكسج، تقليم خارج كل شريحة لإزالة أي حواف غير مستوية والغراء نهاية كل شريحة على قطعة واسعة من ستة ملليمتر من تعقيم حزام توقيت الطابعة البولي يوريثين مع الأسلاك المعدنية جزءا لا يتجزأ. ضع شرائح القلب المدعومة في لوحات ستة آبار تحتوي على ستة ملليلترات من الثقافة المتوسطة في البئر واستخدم ملقطًا معقمة للتأكد من أن الأنسجة في وسط البئر. الحرص على أن غطاء لوحة لن تلمس الأنسجة ووضع لوحة على لوحة الثقافة بحيث الجانب المنحني من لوحة تغطية مباريات مع الجانب الزاوية من لوحة وأن الزوايا مربع يصطف.
ضع الشرائح في حاضنة 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. استبدل المستنبتات الثقافية بستة ملليلترات من الاستزراع الطازج المُكدّم بالأوكسيجين ثلاث مرات في اليوم. قم بتوصيل الغطاء بمحفز كهربائي لثقافة الخلية وضبط المحفز لتقديم 10 فولت من الكهرباء باستمرار وتردد 1.2 هرتز لشرائح القلب.
بعد توصيل التحفيز، ستبدأ شرائح القلب في الخفقان. كل يوم خلال تغيير وسائل الإعلام في منتصف النهار، واستبدال غطاء لوحة التحفيز من طبق الثقافة لمنع إطلاق جزيئات الجرافيت السامة في وسط الثقافة. إدراج المكونات رغوة بيضاء حيث الغطاء المستخدم يتصل الكابل لثقافة الخلية الكهربائية محفز لمنع تلف المياه إلى الدائرة الكهربائية ووضع غطاء لوحة في حمام من الماء autoclaved تكملة مع 2X المضادات الحيوية / antimycotic.
في اليوم التالي، تطهير غطاء لوحة في حمام الإيثانول 70٪ لمدة خمس إلى 15 دقيقة قبل نقل الغطاء إلى حمام المياه الطازجة autoclaved تكملها مع 2X المضادات الحيوية / مضاد للوميكوتيك لمدة ثلاث دقائق. بعد شطف غطاء اللوحة، استخدم مسح نظيف خال من الوبر رش الإيثانول لإزالة أي ماء متبقي من الأجزاء البلاستيكية وإزالة قابس الرغوة الأبيض. الغلاف ثم على استعداد لوضعها مرة أخرى في لوحة الثقافة.
باستخدام هذا الإعداد ثقافة المحاكاة الحيوية الجديدة كما هو موضح، تم الحفاظ على صلاحية شرائح قلب الخنزير لمدة ستة أيام كما تم تقييمها من قبل MTT المقايسة. في الأيام الستة الأولى ، على غرار الاستجابات الملاحظة لشرائح القلب الطازجة ، لا توجد عابرات الكالسيوم العفوية داخل شريحة قلب الخنزير cardiomyocytes. لم يستجيب القلب إلى التحفيز الكهربائي الخارجي وبيتا الأدرينالية.
بالإضافة إلى ذلك، تم الحفاظ على القوة المتعاقدة والاستجابات للisoproterenol في ثقافة شريحة القلب لمدة تصل إلى ستة أيام مماثلة لتلك التي لوحظت في شرائح القلب الطازجة. يمكن إجراء العديد من التقييمات الهيكلية والوظيفية على شرائح القلب بما في ذلك مقايسات القدرة على البقاء MTT ، ومناعة المناعة ، والمجهر الإلكتروني ، والقياسات العابرة للكالسيوم ، وتقييمات وظيفة التقلص ، والتقييمات الأيضية ، والتحليل. ونحن نستخدم حاليا هذا النظام الثقافي لاختبار السمية القلبية الحادة وفعالية الأدوية والعلاجات الجينية التي تهم شرائح قلب الخنزير والإنسان.
