تولد استراتيجية استبعاد الخلايا العصبية باستخدام فرز FACS السلبي معدلات تسلسل RNA عالية الجودة لعدد خلايا منخفض الوفرة ، مثل الخلايا الجذعية العصبية والخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن ، لدراسة دورها في تعديل تكوين الخلايا العصبية الحصينية البالغة. باستخدام هذه الطريقة ، من الممكن تكييف اختيار الجسم المضاد في بوابة FACS ، مما يجعل هذا البروتوكول متعدد الاستخدامات للغاية في معالجة الأسئلة البيولوجية المختلفة المتعلقة بالتلفيف المسنن. تم تصميم هذه الطريقة في المقام الأول للتحقيق في مكانة الحصين الكبار.
ومع ذلك ، يمكن تكييفها بسهولة لدراسة منافذ الخلايا الجذعية الأخرى. ستوضح الإجراء سارة أحمد دي برادو ، زميلة تدريب ما بعد الدكتوراه في معهد فرانسيس كريك. للبدء ، انقل الدماغ الذي تم تشريحه من الفأر الرحيم إلى طبق بتري 10 سم مليء ب PBS المثلج.
ثم ضع طبق بتري على الجليد وقطع الدماغ إلى نصفين على طول المحور السهمي. باستخدام مشرط ، قم بإزالة المخيخ. نقل نصف الدماغ إلى طبق بتري الجديد 10 سم وضعت على الجليد ، التي تحتوي على PBS الجليد البارد.
قم بتشريح التلفيف المسنن ، أو DG ، باستخدام مناظير ، وكرر هذه الخطوة للحصول على DG الثاني من النصف الثاني من الدماغ. انقل المديرين العامين إلى خالط Dounce المبرد مسبقا وأضف 1 ملليلتر من مخزن التجانس البارد أو HB. تجانس الأنسجة مع 10 ضربات من المدقة A فضفاضة ، تليها 15 السكتات الدماغية من المدقة B ضيقة. انقل التجانس إلى أنبوب مبرد مسبقا سعة 15 ملليلتر.
شطف الخالط Dounce مع 1 ملليلتر من HB الباردة ودمجها مع نفس الأنبوب. أضف 3 ملليلتر من HB إلى أنبوب 15 ملليلتر ، واحتضانه لمدة 5 دقائق على الجليد. امزج معلق النوى هذا مرتين عن طريق قلب الأنبوب برفق.
باستخدام 0.5 ملليلتر من HB ، قم بترطيب غطاء المصفاة 70 ميكرومتر مسبقا فوق أنبوب اختبار 50 ملليلتر ، ثم صفي معلق النواة قبل غسل مصفاة الخلية ب 0.5 ملليلتر من HB. بعد ذلك ، قم بإزالة مصفاة الخلية وأجهزة الطرد المركزي أنبوب الاختبار في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات برفق في 4 ملليلتر من HB باستخدام ماصة P1000.
بعد 5 دقائق من الحضانة على الجليد ، قم بالطرد المركزي للتعليق عند 500 × جم لمدة 10 دقائق ، عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 3 ملليلتر من وسائط الغسيل. استخدم 0.5 ملليلتر من وسائط الغسيل لتبليل غطاء مصفاة 35 ميكرومتر مسبقا على أنبوب اختبار 50 ملليلتر.
ثم صفي معلق النوى عن طريق سحب 0.5 ملليلتر من التعليق في المرة الواحدة ، باستخدام ماصة P1000. بعد غسل غطاء المصفاة ب 0.5 ملليلتر من وسائط الغسيل ، ضع الأنبوب على الثلج. انقل الراشح إلى أنبوب جديد سعة 15 ملليلتر وقم بطرده بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق و 4 درجات مئوية ، عند 500 × جم.
تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 3 ملليلتر من وسائط الغسيل. كرر الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في 1 ملليلتر من وسائط الغسيل باستخدام الجسم المضاد للفأر المضاد ل NeuN و Alexa Fluor 488 و 1 ميكروغرام لكل ملليلتر DAPI. احتضان رد الفعل لمدة 45 دقيقة على الجليد في الظلام.
لفرز النوى المنشطة بالتألق ، أو FANS ، انقل معلق النوى الملطخة بالمناعة إلى أنبوب اختبار سعة 5 ملليلتر ، وضعه على الجليد حتى بدء إجراء قياس التدفق الخلوي. دوامة العينات لمدة 3 ثوان ، بكثافة خفيفة ، قبل وضع الأنابيب في أداة FACS. للحصول على البيانات من تعليق النوى الملطخة ، اضبط البوابات في ارتفاع DAPI ومنطقة DAPI لاستبعاد حطام الخلية والنواة المجمعة.
ثم قم بتعيين البوابات في منطقة التشتت الجانبي للسجل ، أو SSC ، ومنطقة تشتت السجل الأمامي ، أو FSC ، لفصل النوى المفردة عن الركام الملون DAPI المتبقي أو حطام الخلية. ثم عزل السكان السالبة NeuN-AF488 عن طريق ضبط بوابات منطقة مكافحة NeuN-AF488 و FSC. بعد التحليل ، قم بفرز السكان السلبيين المضاد ل NeuN-AF488 في أنبوب تجميع 1.5 ملليلتر مملوء ب 50 ميكرولتر من وسائط الغسيل باستخدام استراتيجية البوابة.
بمجرد الانتهاء من الفرز ، أضف 1 ملليلتر من PBS يحتوي على 1٪ من ألبومين مصل البقر ، أو BSA ، إلى أنبوب التجميع لجمع قطرات من جدار الأنبوب وطرد الأنبوب بالطرد المركزي عند 500 × جم ، لمدة 5 دقائق ، عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، واترك 50 ميكرولترا من المذاب لإعادة تعليق نوى الطرد المركزي. في أنبوب دقيق سعة 0.5 ملليلتر ، أضف 5 ميكرولتر من معلق النوى إلى 5 ميكرولتر من التريبان الأزرق.
قم بقياس التركيز وتقييم صلاحية معلق الخلية الواحدة باستخدام عداد خلية آلي قبل إجراء إعداد المكتبة وتسلسل النوى. كشفت مجموعات المعلوماتية الحيوية عن مجموعات منفصلة جيدا من النوى تتوافق مع أنواع الخلايا المعروفة داخل DG ، مع أو بدون FANS. ضمن العينة غير المصنفة من قبل FACS ، كانت معظم النوى المتسلسلة عالية الجودة 84.9٪ من الخلايا العصبية.
وهو يتألف من ثلاث مجموعات من الخلايا العصبية ، مما يشير إلى إمكانية أن تكون مجموعات الخلايا الأكثر تمثيلا في التلفيف المسنن هي الخلايا العصبية الحبيبية ، والخلايا العصبية المثيرة الأخرى ، والخلايا العصبية المثبطة. ضمن العينة غير المصنفة من قبل FACS ، كانت المجموعات غير العصبية المحددة تتكون في الغالب من 11.1٪ من أنواع الخلايا الدبقية ، بما في ذلك الخلايا النجمية ، والخلايا قليلة التغصن ، وخلايا السلائف قليلة التغصن ، و 3.3٪ الخلايا المناعية ، و 0 ، 6٪ خلايا Cajal-Retzius. أثناء إجراء FANS لاستبعاد السكان الإيجابيين ل NeuN ، أصبحت مجموعات الخلايا الدبقية بارزة ، مع 81.3٪ من إجمالي النوى.
بالنسبة للعينات المتسلسلة عند 50،000 قراءة لكل نواة ، تم الكشف عن 25،010 جينا لكل نواة للعينة غير المصنفة من قبل FACS ، و 1،665.5 جينا لعينة FANS سلبية NeuN ، مما يؤكد أن التنميط النسخي عالي الجودة للنوى المفردة وفرز FACS لا يضر بالنوى ل snRNA-seq اللاحقة. كان للنسبة العالية من الخلايا العصبية في العينة غير المصنفة من قبل FACS نشاط نسخ أعلى من 2،660 جينا لكل نواة و 6،170 نسخة لكل نواة في العينة غير المصنفة من FACS من أنواع الخلايا غير العصبية بمتوسط نشاط نسخي يبلغ 1،090 جينا لكل نواة و 1،785 نسخة لكل نواة. بمجرد إنشاء البيانات باستخدام هذا البروتوكول ، يجدر النظر في هذه الطرق المتعامدة الجديدة مثل الأعراض الخاصة أو الدراسات في الجسم الحي للتحقق من صحة أي نتائج.
