Die Strategie, Neuronen mit negativer FACS-Sortierung auszuschließen, erzeugt qualitativ hochwertige RNA-Sequenzierungsraten von Zellpopulationen mit geringer Abundanz, wie neuronalen Stammzellen, Astrozyten und Oligodendrozyten, um ihre Rolle bei der Modulation der adulten Neurogenese des Hippocampus zu untersuchen. Mit dieser Methode ist es möglich, die Wahl des Antikörpers im FACS-Gating anzupassen, was dieses Protokoll sehr vielseitig macht, um verschiedene biologische Fragen im Zusammenhang mit dem Gyrus dentatus zu beantworten. Diese Methode wurde in erster Linie entwickelt, um die erwachsene Hippocampus-Nische zu untersuchen.
Es könnte jedoch leicht für die Untersuchung anderer Stammzellnischen angepasst werden. Sara Ahmed de Prado, Postdoktorandin am Francis Crick Institute, demonstriert das Verfahren. Um zu beginnen, übertragen Sie das von der euthanasierten Maus sezierte Gehirn in eine 10 Zentimeter große Petrischale, die mit eiskaltem PBS gefüllt ist.
Dann legen Sie die Petrischale auf Eis und schneiden Sie das Gehirn in zwei Hälften entlang der sagittalen Achse. Entfernen Sie mit einem Skalpell das Kleinhirn. Übertragen Sie eine Hälfte des Gehirns in die neue 10-Zentimeter-Petrischale auf Eis, die eiskaltes PBS enthält.
Sezieren Sie den Gyrus dentatus oder DG mit einem Fernglas und wiederholen Sie diesen Schritt, um die zweite DG aus der zweiten Hälfte des Gehirns zu erhalten. Geben Sie die beiden DGs in den vorgekühlten Dounce-Homogenisator und fügen Sie 1 Milliliter kalten Homogenisierungspuffer oder HB hinzu. Homogenisieren Sie das Gewebe mit 10 Schlägen des losen A-Stößels, gefolgt von 15 Schlägen des engen B-Stößels. Das Homogenat wird in ein vorgekühltes 15-Milliliter-Röhrchen überführt.
Spülen Sie den Dounce-Homogenisator mit 1 Milliliter kaltem HB ab und kombinieren Sie ihn mit demselben Röhrchen. 3 Milliliter HB in das 15-Milliliter-Röhrchen geben und 5 Minuten auf Eis inkubieren. Mischen Sie diese Kernsuspension zweimal, indem Sie das Röhrchen vorsichtig umdrehen.
Mit 0,5 Milliliter HB die 70 Mikrometer lange Siebkappe über einem 50-Milliliter-Reagenzglas vorbefeuchten, dann die Kernsuspension abseihen, bevor das Zellsieb mit 0,5 Milliliter HB gewaschen wird. Als nächstes entfernen Sie das Zellsieb und zentrifugieren das Reagenzglas in einer Schaufelzentrifuge bei 500 x g für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 4 Milliliter HB mit einer P1000-Pipette.
Nach 5 Minuten Inkubation auf Eis zentrifugieren Sie die Suspension bei 500 x g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 3 Milliliter Waschmedien. Verwenden Sie 0,5 Milliliter Waschmedien, um eine 35-Mikrometer-Siebkappe über einem 50-Milliliter-Reagenzglas vorzubenetzen.
Dann seihen Sie die Kernsuspension ab, indem Sie 0,5 Milliliter Suspension gleichzeitig mit einer P1000-Pipette pipettieren. Nachdem Sie die Siebkappe mit 0,5 Milliliter Waschmedium gewaschen haben, legen Sie das Röhrchen auf Eis. Das Filtrat in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen überführen und 5 Minuten und 4 Grad Celsius bei 500 x g zentrifugieren.
Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 3 Milliliter Waschmedien. Wiederholen Sie die Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter Waschmedium mit dem Maus-Anti-NeuN, Alexa Fluor 488-konjugierten Antikörper und 1 Mikrogramm pro Milliliter DAPI. Inkubieren Sie die Reaktion für 45 Minuten auf Eis im Dunkeln.
Für die fluoreszenzaktivierte Kernsortierung oder FANS wird die immungefärbte Kernsuspension in ein 5-Milliliter-Reagenzglas überführt und bis zum Beginn der Durchflusszytometrie auf Eis gelegt. Wirbeln Sie die Proben 3 Sekunden lang mit leichter Intensität durch, bevor die Röhrchen in das FACS-Instrument eingesetzt werden. Um die Daten aus der gefärbten Kernsuspension zu erhalten, stellen Sie die Gatter in DAPI-Höhe und den DAPI-Bereich so ein, dass die Zelltrümmer und die aggregierten Kerne ausgeschlossen werden.
Legen Sie dann die Gatter im Bereich Log Side Scatter (SSC) und FSC (Log Forward Scatter) fest, um die einzelnen Kerne vom verbleibenden DAPI-gefärbten Aggregat oder Zelltrümmern zu trennen. Isolieren Sie dann die NeuN-AF488-negative Population, indem Sie die Tore für den Anti-NeuN-AF488- und FSC-Bereich setzen. Sortieren Sie nach der Analyse die Anti-NeuN-AF488-negative Population in einem 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen, das mit 50 Mikrolitern Waschmedien gefüllt ist, nach der Gating-Strategie.
Sobald die Sortierung abgeschlossen ist, fügen Sie 1 Milliliter PBS mit 1% Rinderserumalbumin oder BSA in das Sammelröhrchen hinzu, um Tröpfchen von der Wand des Röhrchens zu sammeln, und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 x g für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand und lassen Sie 50 Mikroliter gelöst, um zentrifugierte Kerne zu resuspendieren. In einem 0,5-Milliliter-Mikroröhrchen werden 5 Mikroliter der Kernsuspension zu 5 Mikrolitern Trypanblau hinzugefügt.
Messen Sie die Konzentration und beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Einzelzellsuspension mit einem automatisierten Zellzähler, bevor Sie die Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung der Kerne durchführen. Bioinformatisches Clustering zeigte gut getrennte Gruppen von Kernen, die bekannten Zelltypen innerhalb der DG entsprechen, mit oder ohne FANS. Innerhalb der nicht FACS-sortierten Probe waren die meisten der qualitativ hochwertigen sequenzierten Kerne 84,9% der Neuronen.
Es bestand aus drei Gruppen von Neuronen, was auf die Möglichkeit hinweist, dass die repräsentativsten Zellpopulationen im Gyrus dentatus granuläre Neuronen, andere erregende Neuronen und hemmende Neuronen sind. Innerhalb der nicht FACS-sortierten Probe bestanden die identifizierten nicht-neuronalen Cluster hauptsächlich aus 11,1% der Gliazelltypen, einschließlich Astrozyten, Oligodendrozyten und Oligodendrozytenvorläuferzellen, 3,3% Immunzellen und 0,6% Cajal-Retzius-Zellen. Während der Durchführung von FANS zum Ausschluss von NeuN-positiven Populationen wurden die Cluster von Gliazellen mit 81,3% der gesamten Kerne prominent.
Für die Proben, die mit 50.000 Lesevorgängen pro Kern sequenziert wurden, wurden 25.010 Gene pro Kern für die nicht FACS-sortierte Probe und 1.665,5 Gene für die NeuN-negative FANS-Probe nachgewiesen, was bestätigt, dass eine qualitativ hochwertige transkriptomische Profilierung einzelner Kerne und FACS-Sortierung die Kerne für nachfolgende snRNA-seq nicht schädigt. Der hohe Anteil an Neuronen in der nicht-FACS-sortierten Probe hatte eine höhere Transkriptionsaktivität von 2.660 Genen pro Kern und 6.170 Transkripten pro Zellkern in der nicht-FACS-sortierten Probe als die nicht-neuronalen Zelltypen mit einer durchschnittlichen Transkriptionsaktivität von 1.090 Genen pro Zellkern und 1.785 Transkripten pro Zellkern. Sobald die Daten mit diesem Protokoll generiert wurden, lohnt es sich, diese neuen orthogonalen Methoden wie spezielle Symptome oder In-vivo-Studien in Betracht zu ziehen, um etwaige Ergebnisse zu validieren.
