A estratégia para excluir neurônios usando classificação FACS negativa gera taxas de sequenciamento de RNA de alta qualidade da população celular de baixa abundância, como células-tronco neurais, astrócitos e oligodendrócitos, para estudar seu papel na modulação da neurogênese hipocampal adulta. Com este método, é possível adaptar a escolha do anticorpo no gating FACS, o que torna este protocolo muito versátil na abordagem de várias questões biológicas relacionadas com o giro dentado. Este método é projetado principalmente para investigar o nicho hipocampal adulto.
No entanto, poderia ser facilmente adaptado para estudar outros nichos de células-tronco. A demonstrar o procedimento estará Sara Ahmed de Prado, bolseira de formação pós-doutoral no Instituto Francis Crick. Para começar, transfira o cérebro dissecado do rato eutanasiado para uma placa de Petri de 10 centímetros cheia de PBS gelado.
Em seguida, coloque a placa de Petri no gelo e corte o cérebro em duas metades ao longo do eixo sagital. Usando um bisturi, remova o cerebelo. Transfira metade do cérebro para a nova placa de Petri de 10 centímetros colocada no gelo, contendo PBS gelado.
Disseque o giro dentado, ou DG, usando binóculos, e repita este passo para obter o segundo DG da segunda metade do cérebro. Transfira os dois DGs para o homogeneizador Dounce pré-resfriado e adicione 1 mililitro de buffer de homogeneização a frio, ou HB. Homogeneize o tecido com 10 golpes do pilão A solto, seguido por 15 traços do pilão B apertado. Transfira o homogeneizado para um tubo pré-resfriado de 15 mililitros.
Lave o homogeneizador Dounce com 1 mililitro de HB frio e combine-o com o mesmo tubo. Adicione 3 mililitros de HB ao tubo de 15 mililitros e incube por 5 minutos no gelo. Misture esta suspensão de núcleos duas vezes, invertendo o tubo suavemente.
Usando 0,5 mililitros de HB, pré-molhe a tampa do filtro de 70 micrômetros colocada sobre um tubo de ensaio de 50 mililitros e, em seguida, coe a suspensão dos núcleos antes de lavar o filtro celular com 0,5 mililitros de HB. Em seguida, remova o filtro de células e centrifugar o tubo de ensaio em uma centrífuga de balde oscilante a 500 x g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Descarte o sobrenadante. Ressuspeite suavemente o pellet em 4 mililitros de HB utilizando uma pipeta P1000.
Após 5 minutos de incubação no gelo, centrifugar a suspensão a 500 x g durante 10 minutos, a 4 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3 mililitros de meio de lavagem. Use 0,5 mililitros de meio de lavagem para pré-molhar uma tampa de filtro de 35 micrômetros sobre um tubo de ensaio de 50 mililitros.
Em seguida, coe a suspensão dos núcleos pipetando 0,5 mililitros de suspensão de cada vez, usando uma pipeta P1000. Depois de lavar a tampa do filtro com 0,5 mililitros de meio de lavagem, coloque o tubo no gelo. Transfira o filtrado para um novo tubo de 15 mililitros e centrifuga-o por 5 minutos e 4 graus Celsius, a 500 x g.
Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3 mililitros de meio de lavagem. Repita a centrifugação e ressuspenda o pellet em 1 mililitro de meio de lavagem com o anti-NeuN do rato, o anticorpo conjugado Alexa Fluor 488 e 1 micrograma por mililitro DAPI. Incube a reação por 45 minutos no gelo no escuro.
Para a classificação de núcleos ativados por fluorescência, ou FANS, transfira a suspensão de núcleos imunocorados para um tubo de ensaio de 5 mililitros e coloque-a no gelo até o início do procedimento de citometria de fluxo. Vórtice as amostras por 3 segundos, com intensidade leve, antes de colocar os tubos no instrumento FACS. Para adquirir os dados da suspensão de núcleos corados, defina as portas em altura DAPI e área DAPI para excluir os detritos celulares e os núcleos agregados.
Em seguida, defina as portas na área de dispersão lateral do log, ou SSC, e na área de dispersão de log forward, ou FSC, para separar os núcleos únicos do agregado corado DAPI restante ou dos detritos celulares. Em seguida, isole a população negativa de NeuN-AF488 definindo os portões para a área anti-NeuN-AF488 e FSC. Após a análise, classifique a população negativa anti-NeuN-AF488 em um tubo de coleta de 1,5 mililitro preenchido com 50 microlitros de meio de lavagem usando a estratégia de bloqueio.
Uma vez feita a triagem, adicione 1 mililitro de PBS contendo 1% de albumina sérica bovina, ou BSA, ao tubo de coleta para coletar gotículas da parede do tubo e centrifugar o tubo a 500 x g, por 5 minutos, a 4 graus Celsius. Descarte o sobrenadante, deixando 50 microlitros de soluto para ressuspender núcleos centrifugados. Em um microtubo de 0,5 mililitros, adicione 5 microlitros da suspensão de núcleos a 5 microlitros de azul de tripano.
Meça a concentração e avalie a viabilidade da suspensão de célula única usando um contador de células automatizado antes de realizar a preparação da biblioteca e o sequenciamento dos núcleos. O agrupamento bioinformático revelou grupos bem separados de núcleos correspondentes a tipos celulares conhecidos dentro do GD, com ou sem FANS. Dentro da amostra não classificada pelo FACS, a maioria dos núcleos sequenciados de alta qualidade eram 84,9% dos neurônios.
Composto por três grupos de neurônios, indicando a possibilidade de as populações celulares mais representativas no giro dentado serem neurônios granulados, outros neurônios excitatórios e neurônios inibitórios. Dentro da amostra não classificada pelo FACS, os clusters não neuronais identificados foram feitos principalmente de 11,1% dos tipos de células gliais, incluindo astrócitos, oligodendrócitos e células precursoras de oligodendrócitos, 3,3% de células imunes e 0,6% de células de Cajal-Retzius. Ao realizar FANS para excluir populações positivas de NeuN, os aglomerados de células gliais tornaram-se proeminentes, com 81,3% dos núcleos totais.
Para as amostras sequenciadas em 50.000 leituras por núcleo, 25.010 genes foram detectados por núcleos para a amostra não classificada por FACS e 1.665,5 genes para a amostra FANS NeuN-negativa, confirmando que o perfil transcriptômico de alta qualidade de núcleos únicos e a classificação FACS não danifica os núcleos para snRNA-seq subsequente. A alta proporção de neurônios na amostra não classificada pelo FACS teve uma maior atividade transcricional de 2.660 genes por núcleo e 6.170 transcritos por núcleo na amostra não classificada pelo FACS do que os tipos de células não neuronais com atividade transcricional média de 1.090 genes por núcleo e 1.785 transcritos por núcleo. Uma vez que os dados tenham sido gerados com este protocolo, vale a pena considerar esses novos métodos ortogonais, como sintomas especiais ou estudos in vivo para validar quaisquer achados.
