يصف بروتوكولنا نظاما موثوقا لقياس الانقباض في خلايا عضلة القلب الأولية البشرية البالغة. نظامنا عبارة عن طريقة تسجيل بصري متوسطة الإنتاجية وغير جراحية تقيس باستمرار الانقباض من خلايا متعددة بالتوازي ، وتتيح تتبع تأثيرات الدواء في الوقت الفعلي. تدعم أساليبنا اكتشاف جزيئات جديدة ذات المظهر الجانبي الأكثر طلبا لتصحيح قصور القلب.
كما أنه يوفر نهجا قبل السريري للتنبؤ بمخاطر انقباض الدواء. للبدء ، ضع غطاء زجاجي واحد في كل بئر من صفيحة استزراع ثمانية آبار. تحضير خمسة ميكروجرامات لكل ملليلتر من اللامينين بإضافة 800 ميكرولتر من مخزون اللامينين 521 المؤتلف البشري إلى 7.2 ملليلتر من المحلول B وتخلط جيدا.
أضف 200 ميكرولتر من محلول اللامينين المخفف إلى وسط قسيمة الغطاء. غطي الطبق واكدسه في ثلاجة بدرجة أربع درجات مئوية. تمييع ثنائي ميثيل سلفوكسيد أو DMSO 1000 أضعاف في محلول C لعمل محلول مركبة DMSO 0.1٪.
لاختبار المركب عند واحد و 10 و 100 و 1000 ضعف من تعرضه العلاجي البالغ 0.001 ميكرومولار ، قم بإذابة المركب في DMSO بتركيز مليمول واحد. قم بتخفيف محلول مركب اختبار DMSO بشكل متسلسل باستخدام DMSO لإنتاج ثلاثة مخزونات أخرى. أخيرا ، قم بتخفيف كل مخزون مركب اختبار 1000 قديم في 50 ملليلتر من المحلول C للحصول على تركيزات الاختبار النهائية.
أضف محلول السيارة ومحاليل التركيزات الدقيقة النهائية للمركب إلى محاقن سعة 50 ملليلتر. قم بتوصيل المحاقن بنظام تدفق الجاذبية ، ثم قم بتجهيز نظام تدفق الجاذبية. قم بإزالة لوحة من ثمانية آبار تحتوي على غطاء مغطى بصفح ينزلق من الثلاجة وضع زلة غطاء واحدة في غرفة تسجيل نظيفة.
أعد اللوحة إلى الثلاجة حتى الطلاء التالي. نضح المحلول B من القارورة المتصاعدة للوصول إلى أصغر حجم دون فقد الخلايا. ثم قم بتوزيع 200 ميكرولتر من محلول الخلية في غرفة مجهر التسجيل المثبتة على مرحلة المجهر المقلوب والسماح للخلايا بالاستقرار على انزلاق الغطاء لمدة خمس دقائق.
بعد ذلك ، افتح مجال الرؤية على المجهر وحدد ما إذا كانت كثافة الخلية كافية لبدء التشغيل التجريبي. بمجرد الانتهاء من الطلاء ، قم بموازنة الخلايا لمدة خمس دقائق عن طريق تعطيرها باستمرار بالمحلول C باستخدام نظام نضح تدفق الجاذبية. اضبط الشفط بشكل صحيح ، وقم بتشغيل صندوق التحكم في درجة الحرارة ولوحة التسخين واضبطهما على توصيل 35 درجة مئوية.
ثم على محفز المجال مع زوج من الأسلاك البلاتينية الموضوعة على جوانب متقابلة من الغرفة ، قم بتحفيز الخلايا بجهد فوق عتبة بتردد سرعة هرتز واحد. اضبط سعة النبض المحفز عند فولت واحد وقم بزيادته حتى تبدأ خلايا عضلة القلب في توليد دورات انكماش واسترخاء. حدد الخلايا السليمة ذات التشكل على شكل قضيب والتشققات الواضحة ، ثم اضبط مجال الرؤية وركز على عرض أكبر عدد ممكن من الخلايا المتقلصة.
بعد ذلك ، عرض الصور الرقمية للخلايا داخل برنامج الاستحواذ لنظام تسجيل الانقباض البصري. أثناء تحديد منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار ، تجنب المناطق خارج التركيز والمناطق القريبة من حافة الخلايا. ابدأ التجربة لتقييم تأثيرات المركب.
سيقوم برنامج الاستحواذ بإدارة الحصول على البيانات. عرض وتسمية تركيزات الاختبار ووقت العلاج تلقائيا. قم بتطبيق تركيزات الاختبار إذا ظل الانكماش عند سعة مستقرة طوال فترة خط الأساس للمركبة.
استبعاد الخلايا التي تعرض إما جولة تشغيل أو متهدمة. قم بإجراء تحليل دون اتصال باستخدام برنامج التحليل وماكرو مخصص لمتوسط البيانات. يقوم البرنامج بحساب والإبلاغ عن مقاييس مختلفة من بيانات ديناميكيات القطعة العضلية التي ينتجها برنامج الاستحواذ.
حدد التأثيرات المركبة للاختبار على متوسط سعة الانقباض بالنسبة لحالة التحكم الأساسية المحددة في السيارة لكل خلية عضلية قلبية. عبر عن متوسط النتائج كمتوسط زائد / ناقص SEM وأنتج رسما بيانيا يرسم تأثير تركيز مركب الاختبار على سعة الانقباض. ثم قم بملاءمة منحنى استجابة التركيز مع معادلة التل لاشتقاق قيم IC50 و EC50.
بعد ذلك ، حدد الانقباض اللاحق على أنه انقباض ثانوي تلقائي عابر للخلية العضلية القلبية يحدث قبل الانقباض المنتظم التالي وينتج عنه انقباض غير طبيعي وغير متزامن. حدد فشل الانكماش على أنه عدم قدرة التحفيز الكهربائي على إحداث انكماش. تصور التباين قصير المدى ، أو STV ، والمولدات في مخططات Poincare لتقلب سعة الانكماش.
احسب STV مع آخر 20 عابرا لكل فترة تركيز لمقالة التحكم والاختبار. ثم حدد المولدات على أنها عابرة متكررة وطويلة السعة قصيرة وطويلة. لحساب حالات عدم انتظام ضربات القلب المؤيدة ، قم بتطبيع قيم STV لقيمة التحكم في السيارة لكل خلية ، ورسم الانكماش اللاحق ، وفشل الانكماش ، و STV والمولدات والتعبير عنها كنسبة مئوية من حدوث الخلايا التي تظهر كل إشارة.
أكمل التنميط الميكانيكي متعدد المعلمات بحساب الوقت المستغرق للذروة ، والاضمحلال إلى 30٪ ثم 90٪ استرخاء ، والوقت حتى 90٪ استرخاء ، وطول القطعة العضلية الأساسية ، والوقت حتى 50٪ ذروة ، وارتفاع الذروة ، وطول القطعة العضلية عند ذروة الانقباض ، وأقصى سرعة انكماش ، وأقصى سرعة استرخاء. ثم عبر عن هذه المعلمات بالنسبة لحالة التحكم الأساسية المحددة لكل خلية عضلية قلبية وقم برسمها بيانيا في مخططات استجابة التركيز. تظهر هذه الدراسة التحقق من صحة قياس انقباض عضلة القلب البشرية ، وتأثير تحفيز بيتا الأدرينالية.
لم تكن هناك عابرات انقباض عفوية في خلايا عضلة القلب البشرية ، وتستجيب خلايا عضلة القلب للتحفيز الكهربائي الخارجي مع دورات استرخاء الانقباض ، وكذلك للأيزوبروتيرينول ، وهو ناهض بيتا الأدرينالية. ينتج الأيزوبروتيرينول زيادة تعتمد على التركيز في الانقباض ، كما تم تمييز آثاره على حركية انقباض عابر. بعد قياس الانقباض ، يمكننا إجراء قياس عابر الكالسيوم باستخدام مؤشر الفلورسنت.
تساعد هذه البيانات في تحديد ما إذا كان التغيير في الانقباض يتطلب تغييرا في ديناميكية الكالسيوم. تمهد طريقتنا الطريق لباحثي القلب لتطوير فهم أفضل لعلم وظائف الأعضاء وعلم الأدوية لخلايا عضلة القلب البشرية ، وإنشاء هيكل ونشاط وعلاقات الأدوية الجديدة ، واستكشاف آلية عملها.
