私たちのプロトコルは、成人のヒト一次心筋細胞の収縮性を測定するための信頼性の高いシステムを説明しています。私たちのシステムは、複数の細胞の収縮性を並行して連続的に測定し、薬物効果のリアルタイム追跡を可能にする、中程度のスループットの非侵襲的な光記録法です。私たちの方法は、心不全の矯正に最も望ましいプロファイルを持つ新しい分子の発見をサポートします。
また、薬物誘発性収縮性リスクを予測するための前臨床アプローチも提供します。まず、8ウェル培養プレートの各ウェルにガラスカバースリップを1枚入れます。800マイクロリットルのヒト組換えラミニン521ストックを7.2ミリリットルの溶液Bに加え、よく混合することにより、ラミニン1ミリリットルあたり5マイクログラムを調製する。
200マイクロリットルの希釈ラミニン溶液をカバースリップの中央に加えます。プレートに蓋をして、摂氏4度の冷蔵庫に積み重ねます。ジメチルスルホキシドまたはDMSOを溶液Cで1000倍希釈して、0.1%DMSOビヒクル溶液を作成します。
0.001マイクロモルの治療曝露量の1倍、10倍、100倍、1000倍で化合物を試験するには、化合物を1ミリモルの濃度でDMSOに溶解します。DMSO試験化合物溶液をDMSOで段階希釈し、さらに3つのストックを作製します。最後に、1000年前の各試験化合物ストックを50ミリリットルの溶液Cで希釈して、最終的な試験濃度を取得します。
ビヒクル溶液および化合物の最終マイクロモル濃度の溶液を50ミリリットルのシリンジに加える。シリンジを重力流システムに接続し、重力流システムをプライミングします。ラミネートコーティングされたカバースリップが入った8ウェルプレートを冷蔵庫から取り出し、カバースリップ1枚を清潔な記録チャンバーに入れます。
次のメッキまでプレートを冷蔵庫に戻します。エスカレートしたバイアルから溶液Bを吸引し、細胞を失うことなく最小容量に到達します。次に、倒立顕微鏡のステージに取り付けられた記録顕微鏡チャンバーに200マイクロリットルの細胞溶液を分注し、細胞をカバースリップに5分間沈殿させます。
次に、顕微鏡で視野を開き、細胞密度が実験を開始するのに適しているかどうかを判断します。プレーティングが完了したら、重力流灌流システムを使用して溶液Cで連続的に灌流することにより、セルを5分間平衡化します。吸引力を正しく調整し、温度制御ボックスと加熱プレートをオンにして、摂氏35度になるように設定します。
次に、チャンバーの両側に一対の白金線を配置した電界刺激装置で、1ヘルツのペーシング周波数で閾値超電圧で細胞を刺激します。刺激パルスの振幅を1ボルトに設定し、心筋細胞が収縮-弛緩サイクルを生成し始めるまで振幅を増やします。棒状の形態と明確な縞模様を持つ健康な細胞を選択し、視野を調整し、収縮する細胞をできるだけ多く視界に入れることに集中します。
次に、細胞のデジタル化された画像を光収縮記録システムの取得ソフトウェア内に表示した。関心領域または ROI を選択するときは、焦点が合っていない領域やセルの端に近い領域を避けてください。化合物の効果を評価するための実験を開始します。
データ取得ソフトウェアがデータ取得を管理します。検査濃度と治療時間を自動的に表示し、ラベリングします。収縮がベースライン車両期間全体を通じて安定した振幅にとどまる場合は、テスト濃度を適用します。
ランナップまたはランダウンのいずれかを表示するセルを失格にします。解析ソフトウェアとカスタムメイドのマクロを使用してオフライン解析を実行し、データを平均化します。このソフトウェアは、取得ソフトウェアによって生成されたサルコメアダイナミクスデータからさまざまな指標を計算して報告します。
各心筋細胞の特定のベースラインビヒクル制御条件に対する平均収縮性振幅に対する試験化合物の影響を定量化します。平均結果を平均プラス/マイナスSEMで表し、収縮性振幅に対する試験化合物の濃度効果をプロットしたグラフを作成します。次に、濃度応答曲線を丘陵方程式に当てはめて、IC50 と EC50 の値を導き出します。
次に、後収縮を、次の規則的な収縮の前に発生し、異常で同期されていない収縮を引き起こす心筋細胞の自発的な二次収縮一過性として特定します。収縮の失敗は、電気刺激が収縮を誘発できないことと特定します。短期変動 (STV) と、収縮振幅変動のポアンカレ線図のオルタナンを可視化します。
各対照および試験物の濃度期間の最後の 20 回の過渡現象で STV を計算します。次に、オルタナンを反復的で、短い収縮と長い収縮性を交互に繰り返す振幅トランジェントとして識別します。不整脈誘発性の発生率を計算するには、STV値を各細胞のビヒクル制御値に正規化し、収縮後、収縮不全、STV、およびオルタナンをプロットし、各シグナルを示す細胞の発生率のパーセントとして表します。
ピークまでの時間、30%、90%の緩和までの減衰、90%の緩和までの時間、ベースラインのサルコメア長、50%ピークまでの時間、ピーク高さ、ピーク収縮時のサルコメア長、最大収縮速度、および最大緩和速度を計算して、マルチパラメトリック機構プロファイリングを完了します。次に、これらのパラメータを各心筋細胞の特定のベースラインコントロール条件に関連させて表し、濃度応答プロットにグラフ化します。この研究は、ヒト心筋細胞の収縮性測定の検証、およびベータアドレナリン作動性刺激の効果を示しています。
ヒト心筋細胞には自発的な収縮性過渡現象はなく、心筋細胞は収縮性-緩和サイクルを伴う外部電気刺激、およびベータアドレナリン作動性アゴニストであるイソプロテレノールに応答します。イソプロテレノールは濃度依存的な収縮性の増加をもたらし、収縮性過渡性の動態に対するその影響も特徴付けられました。収縮性の測定に続いて、蛍光指示薬によるカルシウムの過渡性の測定を行うことができます。
このようなデータは、収縮性の変化がカルシウムの動態の変化を必要とするかどうかを判断するのに役立ちます。私たちの方法は、心臓研究者がヒト心筋細胞の生理学と薬理学をよりよく理解し、新薬の構造、活性、および関係を確立し、それらの作用機序を探求するための道を開きます。
