Nuestro protocolo describe un sistema fiable para medir la contractilidad en cardiomiocitos primarios humanos adultos. Nuestro sistema es un método de registro óptico no invasivo de rendimiento medio que mide continuamente la contractilidad de múltiples células en paralelo y permite el seguimiento en tiempo real de los efectos de los fármacos. Nuestros métodos apoyan el descubrimiento de nuevas moléculas con el perfil más deseado para la corrección de la insuficiencia cardíaca.
También proporciona un enfoque preclínico para predecir los riesgos de contractilidad inducidos por fármacos. Para comenzar, coloque una sola cubierta de vidrio en cada pocillo de una placa de cultivo de ocho pocillos. Prepare cinco microgramos por mililitro de laminina añadiendo 800 microlitros de la cepa de laminina recombinante humana 521 a 7,2 mililitros de solución B y mezcle bien.
Agregue 200 microlitros de la solución de laminina diluida en el centro del cubreobjetos. Cubra el plato y apílelo en un refrigerador a cuatro grados centígrados. Diluya dimetilsulfóxido o DMSO 1000 veces en la solución C para hacer una solución para vehículos con DMSO al 0,1%.
Para probar el compuesto a una, 10, 100 y 1000 veces su exposición terapéutica de 0,001 micromolares, disuelva el compuesto en DMSO a una concentración de un milimolar. Diluya la solución del compuesto de prueba DMSO en serie con DMSO para producir tres existencias más. Por último, diluir cada compuesto de ensayo de 1000 años de antigüedad en 50 mililitros de solución C para obtener las concentraciones finales de ensayo.
Agregue la solución del vehículo y las soluciones de las concentraciones micromolares finales del compuesto a jeringas de 50 mililitros. Conecte las jeringas al sistema de flujo por gravedad, luego cebe el sistema de flujo por gravedad. Retire del refrigerador una placa de ocho pocillos que contenga una hoja de cubierta recubierta de laminado y coloque una hoja de cubierta en una cámara de grabación limpia.
Regrese el plato al refrigerador hasta el próximo emplatado. Aspire la solución B del vial escalado para alcanzar el volumen más pequeño sin perder células. A continuación, dispense 200 microlitros de la solución celular en la cámara del microscopio de registro montada en la platina de un microscopio invertido y deje que las células se asienten en el cubreobjetos durante cinco minutos.
A continuación, abra el campo de visión en el microscopio y determine si la densidad celular es adecuada para que comience la ejecución experimental. Una vez realizada la siembra, equilibre las células durante cinco minutos perfundiéndolas continuamente con la solución C utilizando el sistema de perfusión por flujo de gravedad. Ajuste la succión correctamente, encienda la caja de control de temperatura y una placa calefactora y configúrelas para que entreguen 35 grados centígrados.
Luego, en un estimulador de campo con un par de hilos de platino colocados en lados opuestos de la cámara, estimule las células con voltaje supraumbral a una frecuencia de estimulación de un hercio. Ajuste la amplitud del pulso estimulante a un voltio y auméntela hasta que los cardiomiocitos comiencen a generar ciclos de contracción-relajación. Seleccione células sanas con morfología en forma de bastón y estrías claras, luego ajuste el campo de visión y concéntrese en mostrar tantas células de contracción como sea posible.
A continuación, se mostraron las imágenes digitalizadas de las células dentro del software de adquisición del sistema de registro de contractilidad óptica. Al seleccionar la región de interés o el ROI, evite las áreas desenfocadas y las áreas cercanas al borde de las celdas. Inicia el experimento para evaluar los efectos del compuesto.
El software de adquisición gestionará la adquisición de datos. Visualización y etiquetado automático de las concentraciones de prueba y el tiempo de tratamiento. Aplique las concentraciones de ensayo si la contracción se mantiene en una amplitud estable durante todo el período de referencia del vehículo.
Descalifique las celdas que muestran un runup o rundown. Realice análisis fuera de línea utilizando el software de análisis y una macro personalizada para promediar los datos. El software calcula e informa varias métricas a partir de los datos de dinámica del sarcómero producidos por el software de adquisición.
Cuantificar los efectos de los compuestos de ensayo sobre la amplitud media de la contractilidad en relación con la condición de control del vehículo de referencia específica de cada cardiomiocito. Exprese los resultados medios como media más/menos SEM y elabore un gráfico que represente el efecto de la concentración del compuesto de ensayo en la amplitud de la contractilidad. A continuación, ajuste la curva de respuesta de concentración a la ecuación de Hill para obtener los valores de IC50 y EC50.
A continuación, identifique la postcontracción como una contracción secundaria espontánea transitoria del cardiomiocito que se produce antes de la siguiente contracción regular y produce una contracción anormal y no sincronizada. Identifique la falla de contracción como la incapacidad del estímulo eléctrico para inducir una contracción. Visualice la variabilidad a corto plazo, o STV, y las alternancias en los gráficos de Poincaré de la variabilidad de la amplitud de contracción.
Calcule el STV con los últimos 20 transitorios de cada período de concentración de control y artículo de prueba. A continuación, identifique las alternancias como transitorios de amplitud de contractilidad cortos y largos repetitivos, alternando. Para calcular las incidencias de pro-arritmia, normalice los valores de STV al valor de control del vehículo de cada célula, grafique la postcontracción, la falla de contracción, STV y alternans y expréselos como un porcentaje de la incidencia de células que exhiben cada una de las señales.
Complete el perfil mecanicista multiparamétrico con el cálculo del tiempo hasta el pico, la caída al 30% y luego al 90% de relajación, el tiempo hasta el 90% de relajación, la longitud basal del sarcómero, el tiempo hasta el 50% del pico, la altura del pico, la longitud del sarcómero en la contractilidad máxima, la velocidad máxima de contracción y la velocidad máxima de relajación. A continuación, exprese estos parámetros en relación con la condición de control basal específica de cada cardiomiocitos y grafíquelos en gráficos de respuesta a la concentración. Este estudio muestra la validación de la medición de la contractilidad de los cardiomiocitos humanos y el efecto de la estimulación beta-adrenérgica.
No hubo transitorios de contractilidad espontánea en los cardiomiocitos humanos, y los cardiomiocitos responden a la estimulación eléctrica externa con ciclos de contractilidad-relajación, así como al isoproterenol, un agonista beta-adrenérgico. El isoproterenol produce un aumento de la contractilidad dependiente de la concentración, y también se caracterizaron sus efectos sobre la cinética transitoria de la contractilidad. Después de la medición de la contractilidad, podemos realizar la medición del transitorio de calcio con un indicador fluorescente.
Estos datos ayudan a determinar si el cambio en la contractilidad requiere un cambio en la dinámica del calcio. Nuestro método allana el camino para que los investigadores cardíacos desarrollen una mejor comprensión de la fisiología y la farmacología de los cardiomiocitos humanos, establezcan la estructura, la actividad y las relaciones de los nuevos fármacos y exploren su mecanismo de acción.
