Notre protocole décrit un système fiable de mesure de la contractilité dans les cardiomyocytes primaires humains adultes. Notre système est une méthode d’enregistrement optique non invasive à débit moyen qui mesure en continu la contractilité de plusieurs cellules en parallèle et permet un suivi en temps réel des effets des médicaments. Nos méthodes soutiennent la découverte de nouvelles molécules ayant le profil le plus recherché pour la correction de l’insuffisance cardiaque.
Il fournit également une approche préclinique pour prédire les risques de contractilité induite par les médicaments. Pour commencer, placez un seul couvercle en verre dans chaque puits d’une plaque de culture à huit puits. Préparez cinq microgrammes par millilitre de laminine en ajoutant 800 microlitres de laminine recombinante humaine 521 à 7,2 millilitres de solution B et mélangez bien.
Ajouter 200 microlitres de la solution de laminine diluée au centre de la lamelle. Couvrez l’assiette et empilez-la dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Diluer le diméthylsulfoxyde ou le DMSO 1000 fois dans la solution C pour obtenir une solution de véhicule à 0,1 % de DMSO.
Pour tester le composé à une, 10, 100 et 1000 fois de son exposition thérapeutique de 0,001 micromolaire, dissoudre le composé dans du DMSO à une concentration millimolaire. Diluer la solution de composé d’essai de DMSO en série avec du DMSO pour produire trois autres bouillons. Enfin, diluer chaque composé d’essai 1000 dans 50 millilitres de solution C pour obtenir les concentrations d’essai finales.
Ajouter la solution pour véhicule et les solutions des concentrations micromolaires finales du composé dans des seringues de 50 millilitres. Connectez les seringues au système d’écoulement par gravité, puis amorcez le système d’écoulement par gravité. Sortez du réfrigérateur une plaque à huit puits contenant une lamelle de couvercle recouverte de pellicule et placez une plaque de couverture dans une chambre d’enregistrement propre.
Remettez l’assiette au réfrigérateur jusqu’au prochain dressage. Aspirer la solution B du flacon ascensionné pour atteindre le plus petit volume sans perdre de cellules. Versez ensuite 200 microlitres de la solution cellulaire dans la chambre du microscope enregistreur montée sur la platine d’un microscope inversé et laissez les cellules se déposer sur la lamelle pendant cinq minutes.
Ensuite, ouvrez le champ de vision du microscope et déterminez si la densité cellulaire est adéquate pour le début de l’essai. Une fois le placage terminé, équilibrez les cellules pendant cinq minutes en les perfusant continuellement avec la solution C à l’aide du système de perfusion par gravité. Ajustez correctement l’aspiration, allumez le boîtier de contrôle de la température et une plaque chauffante et réglez-les pour qu’ils fournissent 35 degrés Celsius.
Ensuite, sur un stimulateur de champ avec une paire de fils de platine placés sur les côtés opposés de la chambre, stimulez les cellules avec une tension supraseuil à une fréquence de stimulation d’un hertz. Réglez l’amplitude de l’impulsion stimulante à un volt et augmentez-la jusqu’à ce que les cardiomyocytes commencent à générer des cycles de contraction-relaxation. Sélectionnez des cellules saines avec une morphologie en forme de bâtonnet et des stries claires, puis ajustez le champ de vision et concentrez-vous sur le fait de mettre en évidence autant de cellules en contraction que possible.
Ensuite, les images numérisées des cellules sont affichées dans le logiciel d’acquisition du système d’enregistrement de la contractilité optique. Lors de la sélection de la région d’intérêt ou des ROI, évitez les zones floues et les zones proches du bord des cellules. Lancez l’expérience pour évaluer les effets du composé.
Le logiciel d’acquisition gérera l’acquisition des données. Affichage et étiquetage automatique des concentrations d’essai et du temps de traitement. Appliquer des concentrations d’essai si la contraction reste à une amplitude stable pendant toute la durée de la période de référence du véhicule.
Disqualifiez les cellules affichant un point d’arrêt ou un point d’arrêt. Effectuez une analyse hors ligne à l’aide du logiciel d’analyse et d’une macro personnalisée pour faire la moyenne des données. Le logiciel calcule et rapporte diverses mesures à partir des données de dynamique du sarcomère produites par le logiciel d’acquisition.
Quantifier les effets du composé d’essai sur l’amplitude moyenne de la contractilité par rapport à la condition de contrôle de base spécifique du véhicule de chaque cardiomyocyte. Exprimez les résultats moyens sous la forme d’une moyenne de plus/moins MEB et produisez un graphique représentant l’effet de la concentration du composé d’essai sur l’amplitude de la contractilité. Ajustez ensuite la courbe de réponse de la concentration à l’équation de Hill pour en déduire les valeurs IC50 et EC50.
Ensuite, identifiez la post-contraction comme un transitoire de contraction secondaire spontanée du cardiomyocyte qui se produit avant la prochaine contraction régulière et produit une contraction anormale et non synchronisée. Identifiez l’échec de la contraction comme l’incapacité du stimulus électrique à induire une contraction. Visualisez la variabilité à court terme, ou VUT, et les alternans dans les diagrammes de Poincaré de la variabilité de l’amplitude de contraction.
Calculer le VUT avec les 20 derniers transitoires de chaque témoin et de la période de concentration de l’objet d’essai. Identifiez ensuite les alternants comme des transitoires répétitifs, alternant des transitoires d’amplitude de contractilité courte et longue. Pour calculer les incidences de la pro-arythmie, normalisez les valeurs STV à la valeur de contrôle du véhicule de chaque cellule, tracez la postcontraction, l’échec de contraction, le STV et les alternants et exprimez-les en pourcentage de l’incidence des cellules présentant chacun des signaux.
Complétez le profilage mécanistique multiparamétrique avec le calcul du temps jusqu’au pic, de la décroissance à 30 % puis de la relaxation à 90 %, du temps à la relaxation à 90 %, de la longueur du sarcomère de base, du temps jusqu’au pic de 50 %, de la hauteur du pic, de la longueur du sarcomère à la contractilité maximale, de la vitesse de contraction maximale et de la vitesse de relaxation maximale. Exprimez ensuite ces paramètres par rapport à la condition de contrôle de base spécifique de chaque cardiomyocyte et représentez-les graphiquement dans des diagrammes de réponse à la concentration. Cette étude montre la validation de la mesure de la contractilité des cardiomyocytes humains et l’effet de la stimulation bêta-adrénergique.
Il n’y avait pas de transitoires de contractilité spontanée dans les cardiomyocytes humains, et les cardiomyocytes répondent à la stimulation électrique externe avec des cycles de contractilité-relaxation, ainsi qu’à l’isoprotérénol, un agoniste bêta-adrénergique. L’isoprotérénol produit une augmentation de la contractilité dépendante de la concentration, et ses effets sur la cinétique de la contractilité transitoire ont également été caractérisés. Suite à la mesure de la contractilité, nous pouvons effectuer la mesure du transitoire calcique à l’aide d’un indicateur fluorescent.
De telles données aident à déterminer si un changement de contractilité nécessite un changement dans la dynamique du calcium. Notre méthode ouvre la voie aux chercheurs en cardiologie pour développer une meilleure compréhension de la physiologie et de la pharmacologie des cardiomyocytes humains, établir la structure, l’activité et les relations de nouveaux médicaments et explorer leur mécanisme d’action.
