ونود أن ننوه الدكتور سكوت هندرسون للمساعدة في الفحص المجهري متحد البؤر. وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة ل1RO1CA127501 WAB فضلا عن تمويل المشاريع التجريبية من مركز السرطان ماسي وكلية الطب (جامعة فرجينيا كومنولث) لالميكروسكوب WAB أجريت في جامعة فرجينيا كومنولث ، دائرة. بيولوجيا الأعصاب وعلم التشريح مرفق الميكروسكوب ، دعمت ، في جزء منه ، وذلك بتمويل من مركز NIHNINDS 5P30NS047463 منحة الأساسية.

بروتوكول يتكون من ثلاث خطوات رئيسية. الأولى ، والاستنساخ الجيني خطوة من اهتمامك في الثدييات التعبير سوف تناقش ناقلات الأميني الميئوس من إصدارات موحودي و / أو CFP YFP يكون إلا لفترة وجيزة. وترد ترنسفكأيشن من الحمض النووي المتجه الى EA.hy926 الخلايا البطانية ، والتصوير مبائر مع الحنق ، على نحو أكثر عمقا أدناه ؛ الخطوات الثانية والثالثة. 1. بناء المستقبلات CFP YFP وهمي وينبغي الاهتمام المستنسخة مستقبلات الأميني الميئوس من إصدارات محسنة من موحودي CFP وYFP. تقرير من الحنق والتجريبية واعتمادا كبيرا على طول رابط بين الممتدة عبر الغشاء المنطقة وبدء fluorophore 1. لذا ، لا بد من استكشاف أطوال مختلفة من رابط لكل زوج مستقبلات جديدة في إطار التحقيق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> R في الرطوبة أو pcDNA3.1 الجدد ناقلات R أو التي تحتوي على C - موحودي YFP (يمكن الحصول على هذه النواقل من مختبرنا) ، مستقبلات استنساخ اهتمامك في مواقع NheI / EcoRI. * ملاحظة ، إذا لزم الأمر ، NheI متوافق إنزيمات عديدة أخرى بما في ذلك SpeI وXbaI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل ردة فعلك في مناسبة ربط خط recA endA1 الخلية المختصة (التي نستخدمها بشكل روتيني Mach1). تليها المستعمرات الشاشة عن وجود تسلسل الحمض النووي التي تضاف للتحقق من عدم وجود طفرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحصول على التشكل الاستنساخ الجزيئي الناجحة ، وإعداد ترنسفكأيشن الصف الحمض النووي في ناقلات مياه معقمة أو TE Qiagen به ، أو ما شابه ذلك مجموعات الحمض النووي. تقييم التركيز والنقاء باستخدام التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية. وينبغي أن الغلة تكون نموذجية من الحمض النووي في نطاق 100-200 ميكروغرام ، والتي تضعف بشكل روتيني لعمل البورصة 1 ميكروغرام / ميكرولتر. </li></ol> 2. ترنسفكأيشن من خلايا 926 EA.hy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقسام الخلايا EA.hy 926 4 ، ونمت في DMEM - كاملة (+10 ٪ DMEM مصل بقري جنيني + Pen. / بكتيريا) في ساترة ماتيك (رقم 0) 35 ملم مع أطباق المتوسطة مل 2. يمكنك الحصول على أطباق متحفظ ~ 15 (~ 90 ٪ متكدسة في اليوم التالي) من طبق متموجة 15 سم. إعداد طبق واحد لتقييم التعبير عن كل مستقبلات الفردية ، فضلا عن طبق واحد لكل زوج مستقبلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا لاحتضان بين عشية وضحاها في الغلاف الجوي بنسبة 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، يجب أن تكون الثقافات ~ متموجة 70-90 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم ترنسفكأيشن ، وإعداد مجمعات nucleolipid بمزج 2 ميكروغرام من الحمض النووي لمستقبلات ناقلات خيالية (2 ميكرولتر) مع 8 ميكرولتر من Fugene6 في 200 ميليلتر من قبل تحسنت OptiMEM. لأزواج المستقبلة ، مع transfect 1 ميكروغرام لكل المستقبلة ، أي ما مجموعه 2 ميكروغرام (انظر أيضا المناقشة الواردة أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج بلطف بواسطة انقلاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يواصل احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال فترة الحضانة ، وإعداد الخلايا لترنسفكأيشن. نضح قبالة الإعلام الطازجة وتغسل كل لوحة بلطف لفترة وجيزة مع PBS دافئة قبل إضافة 2 مل من قبل تحسنت DMEM - كاملة دون مضادات حيوية (DMEM + FBS). فمن الأهمية بمكان تجنب وجود البنسلين والستربتوميسين ، لأنها أكثر بكثير السامة للخلايا أثناء العلاج مع Fugene6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة من الحكمة أن خلايا معقدة واحتضان لساعات إضافية في 20-24 37 درجة مئوية في جو من 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة ، نضح بعناية وسائل الإعلام من الخلايا وماصة جديدة كاملة ، DMEM بالمضادات الحيوية. ترنسفكأيشن التالية ، يجب بقاء الخلية لا تزال مرتفعة نسبيا ، أي يجب أن يذكر لاحظ وجود خلايا العائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعبير الجيني هو القصوى عادة بعد ساعات إضافية 48-60 بعد ترنسفكأيشن. ومع ذلك ، والتصوير هو ممكن عادة في قصيرة بقدر 24 ساعة. وينبغي إجراء تجارب دوام للتعبير الجين الأمثل. </li></ol> 3. مبائر التصوير والتحليل الحنق يتم إجراء التصوير الخلية الحية على مجهر لايكا AOBS TCS - SP2 ليزر متحد البؤر المسح مجهزة الصمام الثنائي الأزرق (405 نانومتر) ، الأرجون (458 ، 476 ، 488 ، 514 نانومتر). الأخضر HeNe (543 نانومتر) ، والبرتقال HeNe (594 نانومتر) ، والأحمر HeNe (633 نانومتر) ليزر ، وهو PI HCX آبو 63x/1.3 غ عدسة الهدف الجليسرين ، الغمر ، وهي مرحلة XY بمحركات (Märzhäuser) ، وتسيطر عليها بيئيا ( درجة الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون 2) مرحلة الحاضنة (PeCon). ضوابط تجريبية حاسمة للقضاء على fluorophore عبر نقاش بين القنوات الانبعاثات وكذلك لتقييم قضايا التعبير وغير محددة multimerization fluorophore. على هذا النحو ، تستخدم transfections fluorophore واحد لاقامة الدورة كل صورة. الحنق السلبية الضوابط (المعروفة باستخدام مستقبلات noninteracting) سيكون من الضروري القيام بها ، من أجل تحديد الخلفية الحنق الذي يحدث نتيجة لأكثر من التعبير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للقضاء على الحديث المتبادل بين القنوات الانبعاثات لCFP وYFP ، ضع تحكم التعبير CFP في حاضنة المرحلة. استخدام الضوء الأبيض ، وضبط Z - لوح إلى التركيز علىإلى الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين إعدادات النافذة ليرة سورية للكشف عن انبعاث CFP إلى 465-505 نانومتر ، وYFP إلى 525-600 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين رصد كل القنوات الانبعاثات ، تثير CFP في 458 نانومتر. باستخدام AOTF ، تعيين قوة الليزر للقضاء على تنزف ملموس أكثر من CFP في القناة YFP الانبعاثات. حفظ هذا الإعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة أداء نفس الحديث المتبادل YFP (باستخدام تعبير السيطرة YFP) في قناة CFP عن طريق ضبط قوة الإثارة في 514 نانومتر لخلايا معربا عن YFP فقط. حفظ هذا الإعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا المكان التالي شارك في التعبير عن وCFP YFP في حاضنة المرحلة. تسلسل باستخدام الإعداد للبرنامج مبائر ايكا ، حدد الخلايا معربا عن مستويات مماثلة من CFP وYFP مع التعريب الغشاء المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام البرمجيات متقبل لايكا الصور تبيض البرنامج ، تعيين إعدادات المانحة ومتقبل لCFP المحفوظة والإعدادات YFP ، يثير الاحترام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكبير على الخلية ، وتسليط الضوء على عائد استثمار (منطقة المصالح) الذي صور الدمار من YFP هو تحدث على الغشاء الخلوي والبدء في البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتدمير صورة للمتقبل ، وضبط AOTF إلى 100 ٪ في 514 نانومتر ، والسماح ليزر تبييض أن تستمر حتى استنفد 70 ٪ من الانبعاثات YFP. لتسريع التبييض ، وعادة ما يتم اختيار رويس في محور النقطية من الليزر (X - المحور). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء التبييض ، الصورة ، رصد حركة الخلوية ورفض الحصول على القياسات مع حركة ملموس في الطائرة - XY ، وهذه القياسات يمكن تقرير كاذب الحنق الكفاءة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتسجل الصور قبل وبعد التبييض ، لكل من الجهات المانحة (CFP) ، والمتقبلة (YFP) والحنق وتحسب الكفاءة على النحو التالي : المؤسسة فكرة الحنق = (D - D قبل آخر) / D آخر للجميع آخر D&gt; D حيث D مسبقا قبل ودال آخر هو شدة المانحة قبل وبعد photobleaching على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استخدام برامج أحزاب اللقاء المشترك (SAS) لتحديد مدى تقلب التجريبية. </li></ol> 4. ممثل النتائج ترنسفكأيشن الكفاءة وعادة ما بين 30 إلى 40 ٪. على الرغم من النتائج السابقة من قبل الآخرين ، ونحن لم نر أن ترنسفكأيشن والتعبير واحدة من ناقلات تفضل أن الطرف الآخر. في الواقع ، نلاحظ في كثير من الأحيان التعبير الحصري لأحد fluorophore الوهم أو ذاك. الحنق نموذجية الكفاءة تختلف بين النظم مستقبلة. لمستقبلات نظام التعادل ، والقيم النموذجية هي 20-28 ٪ للخلايا الظهارية و19-23 ٪ في الخلايا البطانية. لعناصر سلبية ، إلا أن الكفاءة النموذجية هي (2-3 ٪) أدناه. ومدى التباين انخفاض كبير من ذوي الخبرة. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. ممثل صور transfected الخلايا EA.hy 926 ألف صورة) من مدينة دبي للإنترنت أحادي الطبقة EA.hy الخلية 926. ب) صورة من الخلايا الإسفار المعروضة في (A). C) تراكب من (أ) و (B) ~ يتظاهرون كفاءة ترنسفكأيشن 20-30 ٪. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. ممثل متقبل الصور تبيض تحليل الحنق التي تحدث بين CFP وYFP في زنزانة EA.hy926. انبعاث CFP قناة (لوحات أعلى) والانبعاثات YFP قناة (أسفل فريقين) تم رصدها قبل وحدة photobleaching متقبل آخر. اقتصرت التجارب Photobleaching ل، والحنق من القيم المحسوبة ، ومنطقة داخل المربع الأخضر. يتم عرض الحنق والكفاءة المطلقة من مجموعة عالية (الحمراء 1.0) إلى الأقل (0.0 الأرجواني) على تراكب لتضخيم CFP / YFP دمج الصور لأغراض التوجيه فقط.

<ol>
	<li>Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+transmembrane+signaling+by+cytoplasmic+domain+separation+in+integrins.">Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins.</a> Science. 301, 1720-1725 (2003).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipidmodified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li><li>Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie1-Tie2+interactions+mediate+functional+differences+between+angiopoietin+ligands.">Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands.</a> Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).</li><li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization.">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هناك العديد من الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق النجاح. وأبرز هؤلاء هو التعبير المستويات النسبية بين المستقبلات two خيالية. للتحايل على هذه المشكلة ، يمكن للمرء أن جعل خطوط الخلية مستقرة التعبير عن كل من البروتينات في المصالح ، أو تحديد نسب الأمثل للناقلات الحمض النووي للسماح التعبير ما يعادلها. وبالمثل ، نظرا لغير موحدة ترنسفكأيشن عبر الطبق ، ونادرا ما تكون مستويات بروتين يعادل بين الخلايا. ولذلك ، يجب إيلاء الاهتمام للتمييز &#39;العالية&#39; expressors من &quot;منخفضة&quot;. تلك المستويات &quot;متوسط&quot; عرض من البروتين العائد عادة موثوقة وقابلة للتكرار الحنق الكفاءة. أسلوب واحد مختبرنا اتبعت للتخفيف من هذه المشكلة هو استخدام والفيروسات الغدة lenti إلى التعبير الجيني &quot;حتى&quot;. وعلاوة على ذلك ، وهي طريقة بديلة لتبيض الصور متقبل لتحديد الكفاءة والحنق الانبعاثات توعيتهم. على الرغم من أنه على الرغم من احتمال انبعاث توعية لرصد الخلايا واحد في الوقت الحقيقي ، لقد تم العثور على الصور وتبييض متقبل أن تكون أكثر حساسية وأكثر موثوقية. أخيرا ، يمكن أن تستخدم لرصد التفاعلات الحنق البروتين يمكن أن يكون تحديا ويتطلب الاختيار الدقيق للأطوال رابط لمستقبلات غشاء محدد. علاوة على ذلك ، إضافة C / YFP غالبا ما يؤثر بشكل كبير على مستويات بروتين تعبير وتجميع النتائج في الشبكية في هيولي باطني وجهاز جولجي. ومع ذلك ، لتفاعلات عابرة ، أو غير مستقرة ، والحنق هي المنهجية المثلى لاستخدامها.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11960-069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin- Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15070-063</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>N/A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Opti-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11058-021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FUGENE 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11814443001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslip Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G014C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pcDNA3.1(+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>V790&#x2010;20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mach 1 Competent Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C862003</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

imaging protein-protein interactions in vivo

البروتين البروتين التفاعلات هي السمة المميزة لجميع العمليات الخلوية الأساسية. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه التفاعلات هي عابرة ، أو ضعيفة بقوة ، ومنع التعرف عليهم من خلال وسائل التحليل والكيمياء الحيوية التقليدية مثل مناعي المشترك. في هذا الصدد ، فإن البروتينات الفلورية encodable وراثيا (GFP ، RFP ، الخ) وما يرتبط بها من تداخل الطيف مضان أحدثت ثورة في قدرتنا على رصد التفاعلات الضعيفة في الجسم الحي باستخدام الرنين فورستر نقل الطاقة (الحنق) 1-3. هنا ، ونحن من التفصيل استخدامنا لفحص القرب الحنق مقرها لرصد التفاعلات مستقبلات مستقبلات على سطح الخلايا البطانية.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Protein-protein Interactions in vivo at JoVE.com

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

هذا البروتوكول صورة توضح كيفية البروتين البروتين التفاعلات باستخدام مقايسة القرب الحنق مقرا لها.

التصوير البروتين البروتين التفاعلات في الجسم الحي</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

imaging-protein-protein-interactions-in-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

21.3K Views.  Virginia Commonwealth University. هذا البروتوكول صورة توضح كيفية البروتين البروتين التفاعلات باستخدام مقايسة القرب الحنق مقرا لها.

Video: Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

انقسام اليوبيكويتين الخميرة يستند الغشاء الهجين ثنائي (الأسطورة) النظام : أداة قوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

في الجسم الحي ، الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات على مايكرو نقوش السطوح

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

التحقيق عالية الكثافة ميكروأرس البروتين وظيفية لكشف البروتين البروتين التفاعلات

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by providing improved methodology for the identification of inhibitors for such binding sites and which represent the majority of potential drug targets. The main goal of this paper is to provide a methodological overview of the use and application of the REPLACE strategy which involves computational and synthetic chemistry approaches. REPLACE is exemplified through its application to the development of non-ATP competitive cyclin dependent kinases (CDK) inhibitors as anti-tumor therapeutics. CDKs are frequently deregulated in cancer and hence are considered as important targets for drug development. Inhibition of CDK2/cyclin A in S phase has been reported to promote selective apoptosis of cancer cells in a p53 independent manner through the E2F1 pathway. Targeting the protein-protein interaction at the cyclin binding groove (CBG) is an approach which will allow the specific inhibition of cell cycle over transcriptional CDKs. The CBG is recognized by a consensus sequence derived from CDK substrates and tumor suppressor proteins termed the cyclin binding motif (CBM). The CBM has previously been optimized to an octapeptide from p21Waf (HAKRRIF) and then further truncated to a pentapeptide retaining sufficient activity (RRLIF). Peptides in general are not cell permeable, are metabolically unstable and therefore the REPLACE (REplacement with Partial Ligand Alternatives through Computational Enrichment) strategy has been applied in order to generate more drug-like inhibitors. The strategy begins with the design of Fragment ligated inhibitory peptides (FLIPs) that selectively inhibit cell cycle CDK/cyclin complexes. FLIPs were generated by iteratively replacing residues of HAKRRLIF/RRLIF with fragment like small molecules (capping groups), starting from the N-terminus (Ncaps), followed by replacement on the C-terminus. These compounds are starting points for the generation of non-ATP competitive CDK inhibitors as anti-tumor therapeutics.

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

تطوير مثبطات البروتين البروتين التفاعلات استبدال من خلال: تطبيق لتصميم وتطوير غير ATP مثبطات معلمين تنافسي

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

مناعي لونين الفحص لتحديد نبات الأرابيدوبسيس التفاعلات-DNA البروتين<em&gt; في فيفو</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

دراسة لتفاعلات البروتين البروتين في البحوث أوتوفاجي

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

تقنيات الفحص المجهري [كنفوكل] لدراسة تفاعلات البروتين البروتين وحركية في الحمض النووي آفات متقدمة

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

التصوير البروتين البروتين التفاعلات في الجسم الحي

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video