الهدف العام من هذا البروتوكول هو تقديم طريقة محسنة لعزل خلايا الكبد في الفئران بعد استئصال الكبد الجزئي دون الحاجة إلى الطرد المركزي المتدرج الكثافة. عادة ما نرى نسبة كبيرة من خلايا الكبد المحملة بالدهون أثناء التجدد المبكر. عادة ما يتم الاحتفاظ بخلايا الكبد الدهنية التي تفقد عند الطرد المركزي المتدرج للكثافة بسبب الكثافة المنخفضة مع هذا البروتوكول.
لتحضير معدات التروية ، قم بتوصيل قنية IUI قياس 26 بنهاية مخرج الأنبوب باستخدام موصل قفل Luer. ثم اغسل الأنبوب وأدخل طرف مدخل الأنبوب في أنبوب التروية العازلة الذي تم تسخينه مسبقا في حمام مائي. قم بتجهيزه بمخزن مؤقت للتروية الدافئة بسرعة مضخة تبلغ ثلاثة ملليلتر في الدقيقة.
قبل الشروع في الجراحة ، تأكد من تخدير الماوس بشكل كاف. ثم قم بتنظيف البطن بمحلول فرك جراحي و 70٪ إيثانول. ثم قم بقص الغرز لإعادة فتح شق خط الوسط الذي تم إجراؤه مسبقا لاستئصال الكبد الجزئي واسحب حواف الجرح برفق.
إذا كان استئصال الكبد أقدم من 24 إلى 48 ساعة ، فقم بإزالة الخيط وقطع الجلد بالمقص أو المشرط. استخدم مبعدة أو مشابك بسيطة لإبقاء البطن مفتوحا. يجب كشف تجويف البطن قدر الإمكان لتحسين الوصول والتصور.
إصلاح خياطة البولي بروبلين 5-0 إلى القص. اسحبه بشكل جمجمة وقم بإصلاحه في هذا الموقف. حرك الأمعاء إلى اليمين باستخدام مسحات قطنية معقمة للكشف عن الوريد البابي والوريد الأجوف.
استخدم قطعة قماش مبللة للاحتفاظ بالأمعاء. ضع جسما ثقيلا يبلغ ارتفاعه حوالي سنتيمترين مثل حلقة وزن معدنية مجاورة لأرجل الفأر الخلفية. ثم ضع الأنبوب مع قنية IUI المتصلة بقياس 26 على الجسم وضع الإبرة بعناية فوق الوريد الأجوف.
اضبط طول الأنبوب كما هو مطلوب. انقل محلول مرق كولاجيناز إلى أنبوب الهضم العازل الذي تم تسخينه مسبقا. تحضير 10 إلى 20 ملليلتر من العازلة الهضم لكل.
قم بتشغيل المضخة بعد ضبط سرعة المضخة على ثلاثة ملليلتر في الدقيقة. تخلص من أول ملليلترين إلى ثلاثة ملليلتر من محلول التروية الذي تم تسخينه مسبقا بمجرد وصول المخزن المؤقت إلى الإبرة. لإجراء قنية الوريد الأجوف السفلي ، استخدم مسحة قطنية معقمة لسحب الوريد الأجوف برفق أسفل البزل بحيث يسهل التوتر المقدم إدخال القنية في الوريد.
أدخل قنية IUI ذات المقياس 26 بزاوية ضحلة في الوريد الأجوف السفلي أسفل الكلى بينما يمر المخزن المؤقت عبر الإبرة. تأكد من أن الإبرة مائلة تشير إلى الأعلى. ابحث عن الدم في حجرة الفلاش للقسطرة عندما تدخل الإبرة التجويف.
دفع الإبرة بمقدار ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات إضافية لضمان دخول طرف القسطرة إلى الوريد. حرك القسطرة البلاستيكية فوق الإبرة وفي الوريد الأجوف خمسة ملليمترات أخرى. قم بإزالة الإبرة ببطء وبعناية فائقة.
بعد ثانيتين إلى ثلاث ثوان ، ابحث عن بقع بيضاء تتشكل في الكبد أو تورم الوريد البابي ، مما يشير إلى أن مخزن التروية يتدفق عبر الكبد ويدخل فصيصات الكبد من الوريد المركزي. انتظر حتى ينتفخ الوريد البابي بشكل واضح في غضون ثانية إلى ثانيتين من تشكل بقع بيضاء على سطح الكبد. قطع الوريد البابي مع مقص بعيدا قدر الإمكان من هيلوس الكبد.
زيادة معدل التدفق إلى أربعة إلى سبعة ملليلتر في الدقيقة اعتمادا على وزن الحيوان وحجم الكبد ومدى استئصال الكبد الأولي. قم بتثبيت الوريد البابي بملاقط أو مشبك وعائي لمدة سبع إلى 10 ثوان. تأكد من عدم مرور أي سوائل.
قم بإجراء مشبك ثان بعد حوالي 30 ثانية وتأكد من تضخم الكبد واسترخاءه. استمر في طرد الحيوان لمدة ثلاث إلى أربع دقائق ولاحظ المخزن المؤقت الواضح المتدفق من الوريد البابي. ثبت الوريد البابي لمدة ثلاث إلى أربع ثوان قبل أن يصل المخزن المؤقت للهضم إلى الكبد.
تأكد من استرخاء الكبد عند إطلاق المشبك وأن سائل التروية يظل صافيا. بمجرد وصول المخزن المؤقت للهضم إلى الكبد ، قم بتثبيت الوريد البابي مرة أخرى. يجب ألا يسترخي الكبد بعد إطلاق التثبيت.
هضم لمدة أربع دقائق تقريبا بمعدل تدفق خمسة ملليلتر في الدقيقة. مع تقدم عملية الهضم ، ابحث عن علامات بدء انتفاخ الكبد وأقسام شفافة صغيرة على سطح الكبد. لاحظ أن الكبد يأخذ نسيج قطعة قماش مبللة ويبدو رطبا تقريبا.
تحقق من الاتساق عن طريق لمسه بعناية بقطعة قطن رطبة ومعقمة. استمر في التروية حتى يمكن ملاحظة اختلاف ملحوظ في نسيج سطح الكبد. لاحظ أن الكبد يفترض لونا فاتحا جدا ومظهرا شمبانيا يشير إلى انفصال كبسولة جليسون عن الحمة.
توقف عن الهضم بمجرد أن يكتسب الكبد هذه الخصائص. قم بإزالة الإبرة قبل دخول الهواء إلى الكبد. أمسك النسيج الضام المركزي بين الفصوص باستخدام الملقط وارفعه قليلا لأعلى باستخدامه كنقطة ربط.
قطع جميع وصلات الكبد إلى الأعضاء الأخرى وإزالة المرارة. إزالة الكبد بلطف من تجويف البطن. كن حذرا لأنها ستكون واهية وهشة في هذه المرحلة.
ضع الكبد في مخزن حفظ الجليد البارد. انقل الكبد إلى طبق بتري طوله 10 سم وأضف 10 ملليلتر من الثلج البارد Williams'Medium E.Rupture كبسولة Glisson مع ملاقط ذات أطراف دقيقة في مواقع قليلة على طول سطح الكبد. أمسك جزءا مركزيا بزوجين من الملقط.
اسحبها ببطء بعيدا ، مما يسمح للكبسولة بالتمزق دون الإضرار بخلايا الكبد وإطلاق الخلايا عن طريق هز الكبسولة برفق. قم بتصفية خمسة ملليلتر من لب الكبد من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب 50 ملليلتر. شطف المرشح مع 10 ملليلتر من وسط بارد الجليد الطازج وتصفية الخمسة ملليلتر المتبقية من اللب من خلال مصفاة الخلية.
تدور المستخلص عند 50 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. نضح معظم المادة الطافية ، وترك ملليلتر واحد لإعادة تعليق الخلايا عن طريق تحريك الأنبوب برفق. أضف 40 ملليلترا من Williams'E Medium البارد وكرر الخطوة ثلاث مرات.
المضي قدما في عزل خلايا الكبد كما هو موضح في مخطوطة النص. بعد استئصال الكبد بنسبة 70٪ في الفئران ، كان العائد النهائي لخلايا الكبد حوالي 10 إلى 15 × 10 إلى السادس مع 78٪ متوسط الجدوى النهائية. بينما بعد استئصال الكبد الممتد بنسبة 86٪ ، كان إنتاج خلايا الكبد من أربعة إلى تسعة × 10 إلى 6 مع 65٪ متوسط قابلية للحياة.
بعد استئصال الكبد الجزئي ، تظهر خلايا الكبد زيادة في حجم الخلية مقارنة بالكبد الطبيعي المقابل لزيادة محتوى الدهون. لوحظت زيادة محتوى الدهون في خلايا الكبد الفئران بعد 24 ساعة من استئصال الكبد الجزئي ، وينظر إليها على أنها زيادة في التحبب أو لوحظت مباشرة من خلال وجود حويصلات دهنية داخل خلايا الكبد المتضخمة. أثناء استخدام طريقة تنقية تدرج الكثافة الكلاسيكية ، فقدت خلايا الكبد الدهنية الكبيرة في المادة الطافية ويتم جمع خلايا الكبد الخالية من الدهون الأصغر فقط في حبيبات الخلية.
مع البروتوكول المحسن ، لم تفقد خلايا الكبد المملوءة بالدهون وتم تكوير جميع خلايا الكبد. التثبيت المتكرر يسهل عملية التنظيف. مع ذلك ، يتم تطهير الكبد على النحو الأمثل من مكونات الدم المتبقية التي يمكن أن تمنع إنزيمات الهضم.
