このプロトコルの全体的な目標は、密度勾配遠心分離を必要とせずに、部分肝切除後のマウスにおける肝細胞単離のための最適化された方法を提示することです。通常、初期の再生中に脂質を含んだ肝細胞の大部分が見られます。低密度のために密度勾配遠心分離で通常失われるこれらの脂肪肝細胞は、このプロトコルで保持されます。
灌流装置を準備するには、ルアーロックコネクタを使用して、26ゲージのIUIカニューレをチューブの出口端に接続します。次に、チューブを洗い流し、チューブの入口端を水浴中の予熱した灌流バッファーチューブに挿入します。毎分3ミリリットルのポンプ速度で温かい灌流バッファーでプライミングします。
手術を進める前に、マウスが適切に麻酔されていることを確認してください。次に、外科用スクラブ溶液と70%エタノールで腹部を洗浄します。次に、縫合糸を切断して、以前に部分肝切除のために行った正中線切開を再度開き、傷の端をそっと引き離します。
肝切除術が24〜48時間以上経過している場合は、縫合糸を取り除き、ハサミまたはメスで皮膚を切ります。リトラクターまたは単純なクリップを使用して、腹部を開いたままにします。腹腔は、アクセスと視覚化を最適化するために、できるだけ露出させる必要があります。
5-0ポリプロピレン縫合糸を胸骨に固定します。頭蓋骨に引っ張って、この位置に固定します。滅菌綿棒を使用して腸を右に動かし、門脈と大静脈を明らかにします。
腸を保持するために濡れた布を使用してください。マウスの後ろ足に隣接する金属製のウェイトリングなど、高さ約2センチの重いものを置きます。次に、接続された26ゲージIUIカニューレを備えたチューブをオブジェクトに置き、針を大静脈の上に慎重に配置します。
必要に応じてチューブの長さを調整します。コラゲナーゼストック溶液を、予め温めた消化バッファーチューブに移します。動物あたり10〜20ミリリットルの消化バッファーを準備します。
ポンプ速度を毎分3ミリリットルに調整した後、ポンプをオンにします。バッファーが針に到達したら、事前に温めた灌流バッファーの最初の2〜3ミリリットルを廃棄します。下大静脈のカニューレ挿入を行うには、滅菌綿棒を使用して大静脈を穿刺の尾側にそっと引っ張り、提供された張力が静脈へのカニューレの挿入を容易にします。
バッファーが針を通している間、26ゲージのIUIカニューレを腎臓の下の下大静脈に浅い角度で挿入します。針の斜角が上を向いていることを確認します。針が内腔に入ったときにカテーテルのフラッシュチャンバーで血液を探します。
針をさらに2〜3ミリメートル進めて、カテーテルの先端が静脈に入るようにします。プラスチックカテーテルを針の上から大静脈にさらに5ミリメートルスライドさせます。針をゆっくりと慎重に取り外します。
2〜3秒後、灌流バッファーが肝臓を流れ、中心静脈から肝小葉に入っていることを示す、肝臓に形成される白い斑点または門脈の腫れを探します。肝臓表面に白い斑点が形成されてから1〜2秒以内に門脈が目に見えて腫れるのを待ちます。肝門炎からできるだけ遠位にハサミで門脈を切ります。
動物の体重、肝臓の大きさ、および最初の肝切除の程度に応じて、流量を毎分4〜7ミリリットルに増やします。ピンセットまたは血管クランプで門脈を7〜10秒間クランプします。液体が通過していないことを確認してください。
約30秒後に2回目のクランプを実行し、肝臓が腫れて弛緩することを確認します。動物を3〜4分間洗い流し続け、門脈から流れ出る透明な緩衝液を観察します。消化バッファーが肝臓に到達する前に、門脈を3〜4秒間クランプします。
clの解放時に肝臓が弛緩することを確認してくださいamp そして灌流液は透明なままです。消化バッファーが肝臓に到達したら、門脈をもう一度クランプします。クランプを解除した後、肝臓はリラックスしてはいけません。
毎分5ミリリットルの流量で約4分間消化します。消化が進むにつれて、肝臓が腫れ始め、肝臓の表面に小さな透明な部分の兆候を探します。肝臓が濡れた布の質感を帯び、ほとんどねっとりしているように見えることを確認します。
湿らせた滅菌綿棒で慎重に触れて、粘稠度を調べます。肝臓の表面の質感に顕著な違いが観察されるまで灌流を続けます。肝臓が非常に明るい色と、実質から分離しているグリソンカプセルを示す泡立つ外観を想定していることに注意してください。
肝臓がこれらの特性を獲得したらすぐに消化を止めてください。空気が肝臓に入る前に針を外します。鉗子を使用して葉の間の中央結合組織をつかみ、アンカーポイントとして使用してわずかに上に持ち上げます。
肝臓と他の臓器の接続をすべて切断し、胆嚢を取り除きます。肝臓を腹腔からそっと取り除きます。この段階では薄っぺらで壊れやすいので注意してください。
肝臓を氷冷保存バッファーに入れます。肝臓を10センチのペトリ皿に移し、10ミリリットルの氷冷を加えたウィリアムズミディアムE.肝臓表面に沿っていくつかの場所で細い先端ピンセットでグリソンのカプセルを破裂させます。2対のピンセットで中央部分をつかみます。
それらをゆっくりと引き離し、肝細胞を損傷することなくカプセルを引き裂き、カプセルを静かに振って細胞を放出する。5ミリリットルの肝臓パルプを100マイクロメートルのセルストレーナーを通して50ミリリットルのチューブにろ過します。フィルターを10ミリリットルの新鮮な氷冷培地ですすぎ、残りの5ミリリットルのパルプをセルストレーナーでろ過します。
抽出物を摂氏4度で5分間50 gで回転させます。上清の大部分を吸引し、チューブを穏やかに旋回させて細胞を再懸濁するために1ミリリットルを残す。40ミリリットルの冷たいウィリアムズEミディアムを追加し、手順を3回繰り返します。
本文に記載されているように肝細胞の単離を進めます。マウスの70%肝切除術後、最終的な肝細胞収量は約10〜15 x 10〜6番目で、最終生存率は78%でした。.延長86%肝切除後、肝細胞収量は4〜9 x 10〜6番目で、平均生存率は65%でした。
部分肝切除後、肝細胞は、脂質含有量の増加に対応する正常な肝臓と比較して細胞サイズの増加を示す。部分肝切除術の24時間後にマウス肝細胞で脂質含量の増加が観察され、粒状性の増加として見られるか、肥大した肝細胞内の脂質小胞の存在によって直接観察されました。従来の密度勾配精製法を使用している間、大きな脂肪肝細胞は上清で失われ、小さな希薄肝細胞のみが細胞ペレットに集められました。
改善されたプロトコルにより、脂質で満たされた肝細胞は失われず、すべての肝細胞がペレット化されました。繰り返しクランプすることで、フラッシングプロセスが容易になります。これにより、消化酵素を阻害する可能性のある残りの血液成分から肝臓が最適に除去されます。
