Bu protokolün genel amacı, parsiyel hepatektomi sonrası farelerde yoğunluk gradyanı santrifüjlemeye gerek kalmadan hepatosit izolasyonu için optimize edilmiş bir yöntem sunmaktır. Genellikle erken rejenerasyon sırasında lipid yüklü hepatositlerin büyük bir yüzdesini görüyoruz. Genellikle düşük yoğunluk nedeniyle yoğunluk gradyanı santrifüjleme sırasında kaybedilen steatotik hepatositler bu protokol ile korunur.
Perfüzyon ekipmanını hazırlamak için, bir Luer kilit konektörü kullanarak borunun çıkış ucuna 26 gauge IUI kanül bağlayın. Daha sonra boruyu yıkayın ve tüpün giriş ucunu su banyosundaki önceden ısıtılmış perfüzyon tampon tüpüne yerleştirin. Dakikada üç mililitre pompa hızında sıcak perfüzyon tamponu ile hazırlayın.
Ameliyata devam etmeden önce, farenin yeterince uyuşturulduğundan emin olun. Daha sonra karnı cerrahi bir ovma çözeltisi ve% 70 etanol ile temizleyin. Daha sonra parsiyel hepatektomi için daha önce yapılan orta hat insizyonunu yeniden açmak için dikişleri kesin ve yara kenarlarını yavaşça ayırın.
Hepatektomi 24 ila 48 saatten eskiyse, dikişi çıkarın ve cildi makas veya neşterle kesin. Karnı açık tutmak için bir retraktör veya basit klipsler kullanın. Karın boşluğu, erişimi ve görselleştirmeyi optimize etmek için mümkün olduğunca açığa çıkarılmalıdır.
Sternuma 5-0 polipropilen sütür sabitleyin. Kafatası olarak çekin ve bu pozisyonda sabitleyin. Portal damarı ve vena kavayı ortaya çıkarmak için steril pamuklu çubuklar kullanarak bağırsakları sağa doğru hareket ettirin.
Bağırsakları korumak için ıslak bir bez kullanın. Farenin arka ayaklarına bitişik metal bir ağırlık halkası gibi yaklaşık iki santimetre yüksekliğinde ağır bir nesne yerleştirin. Daha sonra tüpü bağlı 26 gauge IUI kanülü ile nesnenin üzerine yerleştirin ve iğneyi dikkatlice vena kavanın üzerine yerleştirin.
Borunun uzunluğunu gerektiği gibi ayarlayın. Kollajenaz stok çözeltisini önceden ısıtılmış sindirim tampon tüpüne aktarın. Hayvan başına 10 ila 20 mililitre sindirim tamponu hazırlayın.
Pompa hızını dakikada üç mililitreye ayarladıktan sonra pompayı açın. Tampon iğneye ulaştığında, önceden ısıtılmış perfüzyon tamponunun ilk iki ila üç mililitresini atın. İnferior vena kava'nın kanülasyonunu gerçekleştirmek için, vena kava'yı delinmenin altına kaudal olarak yavaşça çekmek için steril bir pamuklu çubuk kullanın, böylece sağlanan gerginlik kanülün damar içine sokulmasını kolaylaştırır.
26 gauge IUI kanülünü, tampon iğneden geçerken böbreğin altındaki inferior vena kavaya sığ bir açıyla yerleştirin. İğne eğiminin yukarı doğru işaret ettiğinden emin olun. İğne lümene girdiğinde kateterin flaş odasında kan arayın.
Kateter ucunun damara girmesini sağlamak için iğneyi iki ila üç milimetre daha ilerletin. Plastik kateteri iğnenin üzerine ve vena kavaya beş milimetre daha kaydırın. İğneyi yavaşça ve çok dikkatli bir şekilde çıkarın.
İki ila üç saniye sonra, karaciğerde oluşan beyaz lekeleri veya portal venin şişmesini arayın, bu da perfüzyon tamponunun karaciğerden aktığını ve karaciğer lobüllerine merkezi damardan girdiğini gösterir. Portal damarın, karaciğer yüzeyinde oluşan beyaz lekelerin bir ila iki saniye içinde gözle görülür şekilde şişmesini bekleyin. Portal damarı makasla karaciğer hilusundan mümkün olduğunca distal olarak kesin.
Hayvanın ağırlığına, karaciğer boyutuna ve ilk hepatektominin derecesine bağlı olarak akış hızını dakikada dört ila yedi mililitreye çıkarın. Portal damarı cımbızla veya vasküler bir kelepçeyle yedi ila 10 saniye boyunca kelepçeleyin. Hiçbir sıvının geçmediğinden emin olun.
Yaklaşık 30 saniye sonra ikinci bir kelepçe uygulayın ve karaciğerin şişmesini ve gevşemesini sağlayın. Hayvanı üç ila dört dakika boyunca yıkamaya devam edin ve portal damardan akan berrak tamponu gözlemleyin. Sindirim tamponu karaciğere ulaşmadan önce portal veni üç ila dört saniye sıkıştırın.
Kelepçenin serbest bırakılmasından sonra karaciğerin gevşediğinden ve perfüzyon sıvısının berrak kaldığından emin olun. Sindirim tamponu karaciğere ulaştığında, portal damarı bir kez daha kelepçeleyin. Karaciğer, kelepçelemenin serbest bırakılmasından sonra gevşememelidir.
Dakikada beş mililitrelik bir akış hızında yaklaşık dört dakika sindirin. Sindirim ilerledikçe, karaciğerin şişmeye başladığına dair işaretleri ve karaciğer yüzeyinde küçük şeffaf bölümleri arayın. Karaciğerin ıslak bir bez parçasının dokusunu aldığını ve neredeyse sisli göründüğünü gözlemleyin.
Nemli, steril bir pamuklu çubukla dikkatlice dokunarak kıvamı araştırın. Karaciğerin yüzey dokusunda belirgin bir fark gözlenene kadar perfüzyona devam edin. Karaciğerin çok açık bir renk aldığını ve parankimden ayrılan Glisson kapsülünü gösteren kabarcıklı bir görünüm aldığını gözlemleyin.
Karaciğer bu özellikleri kazanır kazanmaz sindirimi durdurun. Hava karaciğere girmeden önce iğneyi çıkarın. Forseps kullanarak loblar arasındaki merkezi bağ dokusunu kavrayın ve bir ankraj noktası olarak kullanarak hafifçe yukarı doğru kaldırın.
Karaciğerin diğer organlara olan tüm bağlantılarını kesin ve safra kesesini çıkarın. Karaciğeri karın boşluğundan yavaşça çıkarın. Bu aşamada çürük ve kırılgan olacağından dikkatli olun.
Karaciğeri buz gibi soğuk koruma tamponuna yerleştirin. Karaciğeri 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarın ve 10 mililitre buz gibi soğuk Williams'Medium E.Rupture Glisson'un kapsülünü karaciğer yüzeyi boyunca birkaç yerde ince uçlu cımbızla doldurun. İki çift cımbızla merkezi bir kısmı kavrayın.
Onları yavaşça ayırın, kapsülün hepatositlere zarar vermeden yırtılmasına izin verin ve kapsülü hafifçe sallayarak hücreleri serbest bırakın. Beş mililitre karaciğer hamurunu 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin. Filtreyi 10 mililitre taze buz gibi soğuk ortamla durulayın ve kalan beş mililitre hamuru hücre süzgecinden süzün.
Ekstraktı dört santigrat derecede beş dakika boyunca 50 G'de döndürün. Süpernatanın çoğunu aspire edin, tüpü hafifçe döndürerek hücreleri yeniden askıya almak için bir mililitre bırakın. 40 mililitre soğuk Williams'E Medium ekleyin ve adımı üç kez tekrarlayın.
Metin el yazmasında açıklandığı gibi hepatositlerin izolasyonuna devam edin. Farelerde% 70 hepatektomiden sonra, nihai hepatosit verimi% 78 ortalama nihai canlılık ile yaklaşık 10 ila 15 x 10 ila 6. %86 uzatılmış hepatektomi sonrası hepatosit verimi dört ila dokuz x 10 ila 6. sıradaydı ve ortalama %65 canlılık oranına sahipti.
Parsiyel hepatektomilerden sonra, hepatositler, artmış lipid içeriğine karşılık gelen normal karaciğerlere kıyasla artmış bir hücre boyutu gösterir. Parsiyel hepatektomiden 24 saat sonra murin hepatositlerde artmış lipid içeriği gözlendi, granülerlikte bir artış olarak görüldü veya genişlemiş hepatositlerin içinde lipid veziküllerinin varlığı ile doğrudan gözlendi. Klasik yoğunluk gradyanı saflaştırma yöntemi kullanılırken, süpernatantta büyük yağlı hepatositler kaybedildi ve hücre peletinde sadece daha küçük yağsız hepatositler toplandı.
Geliştirilmiş protokol ile lipid dolgulu hepatositler kaybedilmedi ve tüm hepatositler peletlendi. Tekrarlanan kelepçeleme, yıkama işlemini kolaylaştırır. Bununla birlikte, karaciğer, sindirim enzimlerini inhibe edebilecek kalan kan bileşenlerinden en iyi şekilde temizlenir.
