يوضح هذا البروتوكول عدم التجانس في تكوين وهيكل ومورفولوجيا مصائد العدلات خارج الخلية ، اعتمادا على محفزها المحفز في ظل ظروف مماثلة في المختبر في العدلات البشرية من الأفراد الأصحاء. يتم الحصول على نقاء العدلات العالية والجدوى. يسمح ذلك بمقارنة تركيز الحمض النووي ، LL-37 ، ونشاط الإنزيم ل myeloperoxidase و elastase و cathepsin G ، التي تطلقها مصائد العدلات خارج الخلية.
سمح هذا البروتوكول بتحليل تأثير العوامل القابلة للذوبان أو الاتصال الخلوي أو العلاجات أو الآليات الممكنة لإغلاق إنتاج الشبكات في أمراض المناعة الذاتية. هذه الطرق يمكن أن تساعد في التحقيق في أمراض المناعة الذاتية. بسبب تكاثر الخلايا غير المنضبط للشبكات ومدة محاذاة مكوناتها ، والتي تعتبر مؤشرات حيوية للمرض.
يسمح الفحص المجهري الفلوري بالتقاط صورة لشبكات تظهر تشتت الحمض النووي بالاشتراك مع بروتين مثل LL37 ، والذي يتزامن مع الكائنات الحية الدقيقة مما يساعد على فهم كيفية ظهورها. للبدء ، قم بإجراء ثقب الوريد لجمع 10 ملليلتر من الدم المحيطي في أنابيب تحتوي على ثنائي البوتاسيوم EDTA كمضاد للتخثر. ثم قم بإجراء القياس الحيوي القياسي للدم واختبار البروتين التفاعلي C لاستبعاد العدوى أو الالتهاب لضمان جودة العينة.
قم بالطرد المركزي لعينة الدم المحيطية لإزالة البلازما الغنية بالصفائح الدموية ، متبوعة بطرد مركزي ثان وتخلص من البلازما المتبقية. تمييع حزمة كريات الدم الحمراء والكريات البيض الناتجة في نسبة حجم واحد إلى واحد مع واحد DPBS واحد 1X. بعد ذلك، في أنبوب زجاجي معقم حجمه 10 ملليلتر، أودع أولا ملليلترا واحدا من 1.08 جرام لكل محلول كثافة ملليلتر متبوعا بملليلتر واحد يساوي 1.079 جرام لكل محلول كثافة ملليلتر.
ثم ، أضف أربعة ملليلتر من حزمة كرات الدم الحمراء المخففة والكريات البيض عن طريق سكب الجدران. جهاز طرد مركزي بدون تسارع أو تباطؤ لتجنب إزعاج التدرج. نضح المرحلة المقابلة للخلايا المحببة ونقلها إلى أنبوب زجاجي معقم آخر سعة 10 ملليلتر.
اغسل بأربعة ملليلتر من 1X DPBS عند 300 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. لإزالة كريات الدم الحمراء المتبقية ، عالج الخلايا بالصدمة التناضحية بإضافة أربعة ملليلتر من محلول ملحي 0.2٪. احتضان لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية وأجهزة الطرد المركزي.
تخلص من المادة الطافية وأضف أربعة ملليلتر من محلول ملحي 0.65٪. احتضان لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لاستعادة سلامة الغشاء وتكرار الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في أربعة ملليلتر من 1X DPBS لإزالة الحطام الخلوي.
مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي وإعادة تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر من المخزن المؤقت HBSS البارد. لإجراء اختبار استبعاد تريبان الأزرق ، قم بتخفيف خمسة ميكرولتر من معلق الخلية في 20 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان أزرق. عد الخلايا في غرفة باور جديدة وحدد صلاحية الخلية باستخدام اختبار الاستبعاد.
بعد ذلك ، قم بتركيب 5 ميكرولتر من تعليق الخلية على شريحة وصمة عار مع صبغة رايت لمدة 15 ثانية. قم بإصلاح العينة على الفور ، واغسلها بالماء المقطر ، وراقب التشكل تحت المجهر الضوئي. بعد ذلك ، أضف واحدا في 10 إلى الخلايا الخامسة لتدفق أنابيب القياس الخلوي وتلطيخها بميكرولتر واحد من 7AAD في 100 ميكرولتر من مخزن FACS المؤقت لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام.
تغسل مع 500 ميكرولتر من العازلة FACS في 300 غرام لمدة 10 دقائق. ثبت الخلايا ب 500 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهيد وخزنها عند أربع درجات مئوية حتى تحليل التدفق الخلوي. للتحكم في الخلايا الميتة ، قم بإصلاح الخلايا ب 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة واغسلها ب 500 ميكرولتر من 1XPBS عند 300 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
تخلص من المادة الطافية وأضف 200 ميكرولتر من 0.1٪ Triton X-100. احتضان لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية. يغسل مع 500 ميكرولتر من 1X PBS وصمة عار مع 7AAD.
تحليل البيانات التي تم التقاطها في برنامج مقياس التدفق الخلوي. قم بتحميل الملفات وانقر نقرا مزدوجا فوق ملف العدلات غير الملوث. اختر التشتت الأمامي أو FSC على المحور X والتشتت الجانبي أو SSC على المحور Y لعرض عدد الخلايا المقابل للعدلات.
ثم حدد القناة B3-A: PerCP vio 700-A على المحور X لإلغاء تحديد التألق الذاتي للخلايا واختيار الرسم البياني على المحور Y. ثم افتح ملف العدلات الملون. اختر FSC على المحور X و SSC على المحور Y لعرض عدد الخلايا المقابل للعدلات.
مرة أخرى ، حدد القناة B3-A: PerCP vio 700-A لتحديد عدد العدلات الإيجابية للصبغة 7AAD. قم بإنشاء الرسم البياني النهائي بالنقر بزر الماوس الأيمن على النافذة وتحديد نسخ إلى محرر التخطيط. أضف الخيوط الكاذبة البكتيرية أو الفطرية في أنابيب صغيرة سعة 1.5 ملليلتر.
أضف 200 ميكرولتر ، لذلك خمسة ميكرومولار CFSC في 1X PBS. تخلط وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في الظلام. أوقف التفاعل بإضافة 500 ميكرولتر من البلازما وأجهزة الطرد المركزي غير المكملة.
تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات بملليلتر واحد من 1XPBS مع الطرد المركزي. ثم أعد تعليق الكائنات الحية الدقيقة في 250 ميكرولتر من 1X PBS. تحضير 50 ميكرولتر من الأليتيوب في أنابيب دقيقة سعة 1.5 ملليلتر مع اثنين في 10 أس البكتيريا السابعة أو مرتين في 10 أس الخيوط الكاذبة الخامسة للتحريض الصافي.
ضع زلات الغطاء الزجاجي المعقم 10 × 10 ملليمترات في لوحة من 24 بئرا. غطيها ب 10 ميكرولتر من 0.001٪ بولي ل-ليسين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة واغسلها مرتين ب 100 ميكرولتر من 1X PBS. يجف في الهواء ويشع بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
بعد ذلك ، استبدل محلول HBSS لتعليق العدلات الذي تم إعداده مسبقا بوسط RPMI 1640 المكمل ببلازما ذاتية غير مكتملة بالحرارة بنسبة 10٪. أضف 350 ميكرولترا من هذا المعلق الخلوي إلى الصفيحة المكونة من 24 بئرا للحصول على تركيز نهائي قدره اثنان في 10 أس العدلات الخامسة لكل بئر. احتضان اللوحة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح للخلايا بالالتصاق بقاع الآبار.
للحث على تكوين الشبكة ، أضف محفزات البكتيريا MOI100 و pseudohyphae في MOI1. أضف أيضا المنبهات الكيميائية الحيوية وقم بإعداد عنصر تحكم بدون حافز بإضافة 50 ميكرولتر من HBSS. احصل على حجم نهائي يبلغ 400 ميكرولتر لكل بئر واخلطه على شاكر لوحة عند 140 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
ثم احتضان لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحث الصافي ، قم بإزالة المادة الطافية من الآبار عن طريق السحب بعناية وإصلاح الخلايا ب 300 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من 1X PBS بدون طرد مركزي وأضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لمدة 30 دقيقة.
بالنسبة للبقع LL37 ، قم بتخلل الخلايا ب 200 ميكرولتر من 0.2٪ Triton X-100 في 1X PBS لمدة 10 دقائق واغسلها باستخدام 1X PBS مرتين. قم بتركيب الغطاء على الشرائح الزجاجية. يقوم الحمض النووي بتلطيخ الخلايا بميكرولترين من DAPI وتخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتم تحليلها بواسطة الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر.
تم تصور المراحل الخلوية الديناميكية بعد تنقية التدرج مزدوج الكثافة. تم تأكيد مورفولوجيا العدلات النموذجية عن طريق تلطيخ الحق. أظهرت الخلايا أيضا قابلية مثالية لوحظت من خلال استبعاد تريبان الأزرق دون تعطيل الغشاء.
أكد تحليل SSC مقابل FSC عن طريق قياس التدفق الخلوي وجود مجموعة سكانية تتوافق مع PMN بنقاوة خلايا عالية. أشارت مخططات PMN النقطية للخلايا غير الملوثة مقابل خلايا البقع 7AAD والرسوم البيانية الخاصة بها إلى وجود قابلية عالية للخلايا في العدلات المعزولة حديثا مقارنة بخلايا التحكم المخترقة. بعد تحفيز العدلات بالمنشطات الكيميائية والميكروبية ، تم تصور الشبكات بواسطة الفحص المجهري الفلوري باستخدام DNA DPI ومضاد LL37.
كانت الكائنات الحية الدقيقة ملطخة مسبقا ب CFSE. يشار إلى تكوين الشبكة الانتحارية التي يسببها PMA عن طريق التوطين المشترك مع LL37. في حين أن الشبكات التي تشكلت مع HOCI أظهرت تشتتا طفيفا للحمض النووي في الفضاء خارج الخلية الذي يتوافق مع تكوين NET الحيوي.
أظهرت NET التي يسببها الخيوط الكاذبة الفطرية تركيزات منخفضة من الحمض النووي الذي تم إطلاقه في الفضاء خارج الخلية مع هياكل خيطية مميزة لتشكيل NET الحيوي. أظهرت S.aureus تكوينا حيويا لصافي الشبكة بينما حفزت P.aeruginosa إطلاق تركيزات كبيرة من الحمض النووي مع مورفولوجيا غائمة تركزت بشكل مشترك مع LL37 مما يشير إلى تكوين NET الانتحاري. يتيح لنا أداء منهجية التدرج مزدوج الكثافة الحصول على نقاء عالي وصلاحية للعدلات.
ونحن نرفع الغسالات ، ونتجنب إتلاف هيكلها. باتباع هذه الطريقة ، يمكننا تحليل تأثير المواد أو الخلايا في الإنتاج الصافي وكذلك ما إذا كانت متورطة في بعض الآليات أو استخدامها كعلاجات في أمراض المناعة الذاتية.
