Этот протокол демонстрирует неоднородность в составе, структуре и морфологии внеклеточных ловушек нейтрофилов в зависимости от их индуцирующего стимула в сопоставимых условиях in vitro у нейтрофилов человека от здоровых людей. Получена высокая чистота и жизнеспособность нейтрофилов. Это позволяет сравнить концентрацию ДНК, LL-37 и активность ферментов миелопероксидазы, эластазы и катепсина G, высвобождаемых внеклеточными ловушками нейтрофилов.
Этот протокол позволил проанализировать влияние растворимых факторов или клеточного контакта или возможных методов лечения или механизмов закрытия на выработку НЭТ при аутоиммунных заболеваниях. Эти методы могут помочь в исследовании аутоиммунных заболеваний. Из-за неконтролируемого размножения клеток НЭТ и длительности выравнивания их компонентов, которые считаются биомаркерами заболевания.
Флуоресцентная микроскопия позволяет захватывать изображения NETs, показывающие дисперсию ДНК в ассоциации с белком, таким как LL37, который солидаризируется с микроорганизмами, помогая понять, как они появляются. Для начала выполните пункцию вены для сбора 10 миллилитров периферической крови в пробирках, содержащих дикалий ЭДТА в качестве антикоагулянта. Затем выполните стандартную биометрию крови и тест на С-реактивный белок, чтобы исключить инфекцию или воспаление, чтобы обеспечить качество образца.
Центрифугирование образца периферической крови для удаления обогащенной тромбоцитами плазмы с последующей второй центрифугированием и отбрасывание оставшейся плазмы. Развести полученный пакет эритроцитов и лейкоцитов в объемном соотношении один к одному с одним 1X DPBS. Затем в стерильную стеклянную трубку размером 10 миллилитров сначала нанесите один миллилитр 1,08 г на раствор с плотностью миллилитра, а затем один миллилитр 1,079 грамма на раствор с плотностью миллилитра.
Затем добавьте четыре миллилитра разбавленного эритроцита и лейкоцитарного пакета, перелив по стенкам. Центрифуга без ускорения или замедления, чтобы не нарушать градиент. Аспирировать фазу, соответствующую гранулоцитам и перенести в другую стерильную 10-миллилитровую стеклянную трубку.
Вымойте четырьмя миллилитрами 1X DPBS при 300 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте супернатант. Чтобы удалить оставшиеся эритроциты, обработайте клетки осмотическим шоком, добавив четыре миллилитра 0,2% физиологического раствора. Инкубировать в течение двух минут при четырех градусах Цельсия и центрифугировать.
Откажитесь от супернатанта и добавьте четыре миллилитра 0,65% физиологического раствора. Инкубируйте в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы восстановить целостность мембраны и повторить центрифугирование. Удалите супернатант и повторно приостановите клетки в четырех миллилитрах 1X DPBS для удаления клеточного мусора.
Снова центрифугируйте и повторно суспендируйте ячейку гранулы в двух миллилитрах холодного буфера HBSS. Чтобы выполнить тест на исключение трипанового синего цвета, разбавьте пять микролитров клеточной суспензии в 20 микролитрах 0,4% трипан-синего цвета. Подсчитайте клетки в новой камере и определите жизнеспособность клеток с помощью теста на исключение.
Затем установите 5 микролитров клеточной суспензии на слайд и окрасьте пятном Райта в течение 15 секунд. Немедленно зафиксируйте образец, промыть дистиллированной водой и понаблюдать за морфологией под оптическим микроскопом. Далее добавляют один раз 10 к пятой клетке для проточных проточных пробирок цитометрии и окрашивают одним микролитром 7AAD в 100 микролитрах буфера FACS в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия в темноте.
Промывайте 500 микролитрами буфера FACS при 300 G в течение 10 минут. Зафиксируйте клетки 500 микролитрами 2% параформальдегида и храните при четырех градусах Цельсия до анализа проточной цитометрии. Для контроля мертвых клеток зафиксируйте клетки 200 микролитрами 4% параформальдегида в течение 30 минут и промывайте 500 микролитрами 1XPBS при 300 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Выбросьте супернатант и добавьте 200 микролитров 0,1% Triton X-100. Инкубировать в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. Стирайте 500 микролитрами 1X PBS и окрашивайте 7AAD.
Анализируйте полученные данные в программном обеспечении проточного цитометра. Загрузите файлы и дважды щелкните по незапятнанному файлу neutrophil. Выберите прямое рассеяние или FSC по оси X и боковое рассеяние или SSC по оси Y, чтобы отобразить популяцию клеток, соответствующую нейтрофилам.
Затем выберите канал B3-A:PerCP vio 700-A по оси X, чтобы снять ограничение автофлуоресценции ячеек и выберите гистограмму по оси Y. Затем откройте окрашенный файл нейтрофилов. Выберите FSC на оси X и SSC на оси Y, чтобы отобразить популяцию клеток, соответствующую нейтрофилам.
Опять же, выберите канал B3-A: PerCP vio 700-A, чтобы разграничить популяцию нейтрофилов, положительных на краситель 7AAD. Сгенерируйте окончательную гистограмму, щелкнув правой кнопкой мыши по окну и выбрав копировать в редактор макета. Добавьте бактериальные или грибковые псевдогифы в 1,5 миллилитровые микропробирки.
Добавьте 200 микролитров, таким образом, пять микромоляров CFSC в 1X PBS. Перемешать и инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут в темноте. Остановите реакцию, добавив 500 микролитров декомплементированной плазмы и центрифуги.
Выбросьте супернатант и промыть гранулу одним миллилитром 1XPBS центрифугированием. Затем повторно суспендировать микроорганизмы в 250 микролитрах 1X PBS. Подготовьте 50 микролитровых аликвот в 1,5 миллилитра микротрубках с двумя умноженными 10 на седьмую бактерию или два раза по 10 на пятую псевдогифаю для индукции NET.
Поместите 10 на 10 миллиметров стерильной стеклянной крышки в 24-луночную пластину. Накрыть 10 микролитрами 0,001% поли l-лизина в течение одного часа при комнатной температуре и дважды промыть 100 микролитрами 1X PBS. Высушите воздухом и облучите ультрафиолетовым светом в течение 15 минут.
Далее замените HBSS раствор нейтрофильной суспензии, приготовленной ранее, на среду RPMI 1640, дополненную 10% термодемпляционной аутологичной плазмой. Добавьте 350 микролитров этой клеточной суспензии в 24-луночную пластину для конечной концентрации в два раза 10 до пятого нейтрофилов на лунку. Инкубируйте пластину в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом, чтобы ячейки прилипали к дну скважин.
Чтобы индуцировать образование сети, добавьте стимулы бактерий MOI100 и псевдогифы в MOI1. Также добавьте биохимические раздражители и подготовьте контроль без стимула, добавив 50 микролитров HBSS. Получите конечный объем 400 микролитров на лунку и перемешайте на пластинчатом шейкере при 140 об/мин в течение 30 секунд.
Затем инкубируют в течение четырех часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. После чистой индукции удалите супернатант из скважин путем тщательной пипетки и зафиксируйте ячейки 300 микролитрами 4% параформальдегида в течение 30 минут. Промыть ячейки 200 микролитрами 1X PBS без центрифугирования и добавить 200 микролитров блокирующего буфера в течение 30 минут.
Для окрашивания LL37 проницайте клетки 200 микролитрами 0,2% Triton X-100 в 1X PBS в течение 10 минут и дважды промывайте 1X PBS. Установите крышку на стеклянные горки. ДНК окрашивает клетки двумя микролитрами DAPI и хранится при минус 20 градусах Цельсия до анализа конфокальной флуоресцентной микроскопией.
Динамические клеточные фазы визуализировали после очистки с двойным градиентом плотности. Типичная морфология нейтрофилов была подтверждена правильным окрашиванием. Клетки также показали оптимальную жизнеспособность, наблюдаемую при исключении синего трипана без нарушения мембраны.
Анализ SSC в сравнении с FSC методом проточной цитометрии подтвердил популяцию, соответствующую PMN, с высокой чистотой клеток. Точечные графики PMN для неокрашенных клеток по сравнению с клетками окрашивания 7AAD и их соответствующими гистограммами указывали на высокую жизнеспособность клеток в свежеизолированных нейтрофилах по сравнению с пермеабилизированными контрольными клетками. После стимуляции нейтрофилов химическими и микробными стимуляторами НЭТ визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием ДНК DPI и анти-LL37.
Микроорганизмы были предварительно окрашены CFSE. Образование суицидальной сети, вызванное PMA, указывается на колокализацию с LL37. В то время как NETs, сформированные с помощью HOCI, показали незначительную дисперсию ДНК во внеклеточном пространстве, которая соответствовала жизненно важному образованию NET.
NET, индуцированная грибковыми псевдогифаами, показала низкие концентрации ДНК, высвобождаемой во внеклеточное пространство с нитевидными структурами, характерными для жизненно важного образования NET. S.aureus показал жизненно важное образование NET, тогда как P.aeruginosa индуцировал высвобождение больших концентраций ДНК с мутной морфологией, которая совместно локализовалась с LL37, что указывает на образование NET самоубийства. Выполнение методики градиента двойной плотности позволяет получить высокую чистоту и жизнеспособность нейтрофилов.
И мы поднимаем стирки, избегаем повреждения их структуры. Следуя этому методу, мы можем проанализировать влияние веществ или клеток на производство NET, а также то, участвуют ли они в каком-либо механизме или их использовании в качестве терапии при аутоиммунных заболеваниях.
