غالبا ما تفشل طرق الاستزراع الانتشاري التقليدية في تلخيص البيئة المعقدة للأعضاء الحية ، مما يؤدي إلى فقدان العلامات والوظائف الخاصة بالأنسجة. لقد طورنا شريحة مفتوحة تجمع بين ثقافة الانتشار ومبدأ الموائع الدقيقة لتقليد البيئة المكروية للأنسجة الظهارية عن كثب. من خلال تضمين الإشارات البيوكيميائية والميكانيكية الحيوية الموجودة بشكل طبيعي في الأعضاء الحية ولكن غالبا ما يتم إهمالها من قبل النماذج التقليدية في المختبر ، تمثل الرقاقة المفتوحة بديلا أفضل بين الأنظمة المغلقة.
ستوضح العملية Adya Panchal اليوم ، وهي طالبة أبحاث في مختبري. للبدء ، أحضر الكواشف المطلوبة تحت خزانة السلامة البيولوجية على الجليد. زراعة خلايا اللحمة المتوسطة الخاصة بالأنسجة للحصول على التقاء 80٪ إلى 90٪ ثم فصل الخلايا باستخدام التربسين أو طرق أخرى وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
بيليه الخلايا في 250g لمدة خمس دقائق عند 24 درجة مئوية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 225 ميكرولتر لكل من الثلج البارد 10X EMEM والمخزن المؤقت لإعادة البناء. امزج الخلايا عن طريق السحب وأضف 1،800 ميكرولتر من محلول الكولاجين 1 المثلج.
بعد ذلك ، امزج محلول ما قبل الهلام على الجليد عن طريق السحب لأعلى ولأسفل من خمس إلى ست مرات. قم بتحييد محلول ما قبل الهلام ب 18 ميكرولترا من هيدروكسيد الصوديوم العادي ، واخلطه برفق عن طريق السحب ، ثم ماصة 150 ميكرولترا من الهيدروجيل المحمل بالخلايا في الغرفة المركزية للشريحة المفتوحة مع تجنب الفقاعات. قم بتجميع الرقائق في أطباق بتري منفصلة ، بما في ذلك غطاء أنبوب طرد مركزي مملوء بملليلتر من الماء المقطر المزدوج المعقم في كل طبق بتري ، واحتضان أطباق بتري عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
لأداء النقش الدقيق السطحي للهيدروجيل اللحمي ، ماصة 20 ميكرولتر من محلول الكولاجين 1 المحايد قبل الهلام على السطح المزخرف لختم معقم مطبوع ثلاثي الأبعاد وأدخل الختم داخل الغرفة المفتوحة بينما لا يزال هيدروجيل اللحمية في شكل سائل. قم بإزالة أي بقايا هيدروجيل قد تتسرب من أعلى الحجرة المفتوحة باستخدام شفاط. قم بتجميع جميع رقائق البطاطس في أطباق بتري منفصلة مع غطاء أنبوب مخروطي مملوء بالماء كما هو موضح سابقا.
واحتضان جميع أطباق بتري عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 90 دقيقة. في نهاية الحضانة ، أعد الرقائق مرة أخرى تحت خزانة السلامة الحيوية وقم بإزالة الطوابع برفق باستخدام ملاقط دقيقة لتقليل مخاطر إتلاف الهيدروجيل. بمجرد أن تصل الخلايا المستزرعة إلى التقاء 80٪ إلى 90٪ ، قم بفصل الخلايا باستخدام إجراءات الإنزيم المحللة للبروتين على النحو الموصى به من قبل مزود الخلية.
بعد التفكك ، قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا الظهارية إلى كثافة شظايا الخلية المناسبة كما هو موضح في المخطوطة. لزرع الخلية الظهارية ، انقل الرقائق من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية وشطف السطح اللحمي ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الظهارية الطازجة لإزالة أي فائض من محلول الطلاء. بمجرد استنشاق وسط الشطف ، قم بزرع سطح الهيدروجيل ب 50 ميكرولترا من تعليق الخلية الظهارية باستخدام كثافة الخلية المناسبة ، ثم انقل الرقائق مرة أخرى إلى الحاضنة لمدة ساعتين.
لإزالة الحطام الخلوي ، اشطف سطح الهيدروجيل برفق باستخدام وسيط زراعة الخلايا مرتين ، وقم بتحديث الوسط عن طريق التعقيم في حاويات محكمة الغلق قابلة للتعقيم ، وقم بتوصيل الرقائق بالمضخة التمعجية. أوقف المضخة التمعجية مؤقتا ، وافصل الرقائق بعناية عن المضخة ، واستخرج حامل غلاف الرقاقة. بعد نقل الرقائق من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية ، قم بإزالة حجم الوسط الأيسر في الخزان العلوي.
بعد ذلك ، قم بشفط كل الوسط من قناة الموائع الدقيقة العلوية برفق وقم بتثبيت أنبوب الموائع الدقيقة القصير المتصل بالمداخل العلوية باستخدام مشابك الموثق لتقليل تبخر الوسائط وصيانة واجهة الهواء والسائل ، أو ALI. ضع الشريحة المفتوحة على حامل الإسكان مرة أخرى في الحاضنة. أعد توصيل الرقائق بالمضخة التمعجية واستأنف التدفق عن طريق بدء تشغيل المضخة التمعجية.
شطف غرفة الأوعية الدموية مع وسط زراعة الخلايا البطانية ثم البذور 25 ميكرولتر من تعليق الخلايا البطانية. اقلب الرقائق رأسا على عقب للسماح للخلايا البطانية بالالتصاق بالسطح العلوي لغرفة الموائع الدقيقة. ضع الرقائق في أطباق بتري.
ضعها مرة أخرى في الحاضنة كما هو موضح سابقا واترك الخلايا البطانية تلتصق لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، انقل الرقائق من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية وشطف قناة الأوعية الدموية بوسط زراعة الخلايا البطانية مرتين لإزالة الحطام الخلوي. ضع الرقائق بشكل مسطح لتسهيل التصاق الخلايا البطانية بالسطح السفلي للقناة الوعائية.
املأ خزان وسط الأوعية الدموية بوسط زراعة الخلايا الوعائية المفرغة تحت خزانة السلامة الحيوية. ضع الرقائق مرة أخرى داخل حامل غلاف الرقائق وأعد توصيل الرقائق بالخزانات المتوسطة من أحد طرفيها وبالمضخة التمعجية من الطرف الآخر. افحص وصلات الموائع الدقيقة للتأكد من توصيل جميع الرقائق بشكل صحيح وعدم وجود قطرات مرئية من التنقيط المتوسط.
بعد ذلك ، استأنف تدفق السوائل عن طريق بدء تشغيل المضخة التمعجية. يتم تصور سطح الهلام الدقيق مع الخلايا وبدونها. كشف التحليل النسيجي عن بشرة طبقية ناضجة متعددة الطبقات متباينة على الرقاقة.
أظهرت صورة المنظر العلوي لرقاقة الجلد وجود الخلايا الليفية داخل طبقة الجلد. أظهر PECAM-1 و VE-cadherin و von Willebrand تمايز الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة البشرية المزروعة بشكل مشترك في رقاقة الجلد المفتوحة. أظهر MUC5AC ، ألفا وبيتا توبولين ، بروتين خلية الكلورو 16 ، p63 ، و ZO-1 تلطيخ الفلورسنت ظهارة مجرى الهواء الناضجة.
لوحظت أهداب الضرب والظهارة الطبقية الزائفة الناضجة المتمايزة على رقاقة مجرى الهواء المفتوحة. أظهر تلطيخ الفلورسنت من النوع الأول والنوع الثاني و E-cadherin وجود خلايا رئوية ناضجة على الرقاقة. كشف المجهر الإلكتروني عن وجود الزغابات الدقيقة والحويصلات الليزوزومية ، وهو دليل على النمط الظاهري السنخي الناضج.
أظهر التحليل النسيجي وجود خلايا حرشفية مسطحة تتفق مع النمط الظاهري من النوع الأول ، وخلايا شبيهة بالحصى مكعبة متماسكة مع النمط الظاهري من النوع الثاني ، والخلايا الليفية داخل الطبقة الجلدية. تم تأكيد وجود الخلايا المعوية والكأس الناضجة من خلال تلطيخ الميوسين 2 و E-cadherin. أكدت الخلايا الليفية داخل الطبقة الجلدية وجود ظهارة عمودية بسيطة.
يجب أن تكون جميع الكواشف باردة ويجب شطف أسطح الجل بشكل كاف للحصول على سطح مستو. من المهم إزالة أي خلايا وحطام غير ملتصق للحصول على التصاق متساو للخلايا وطبقة أحادية اللون مدمجة وجدار وعائي. يمكن استخدام نهج مماثل لتوليد أنواع أخرى من نماذج الأعضاء الظهارية ، مثل الأمعاء والرئة ، لتقييم كيفية تأثير أدوية معينة أو عوامل بيئية على توازن الأنسجة البشرية ، مع التركيز بشكل خاص على وظيفة الحاجز الظهاري والأوعية الدموية.
مع سهولة الوصول إلى مرحلة الفعالية في حجرة السدى ، يمكن للبحث الآن إنشاء أنماط وجه محددة وإعادة إنتاج بنية الأنسجة الوظيفية ، مثل cryptviveoli ، والتي يصعب تحقيقها مع الأجهزة الأخرى.
