للحصول على رؤية أفضل في تكوين وهيكل الضفيرة المشيمية ، فإن الطريقة الفعالة لعزل الضفيرة المشيمية خارج البطينين في الدماغ هي خطوة أولى لا تقدر بثمن. باستخدام تقنية التشريح المجهري هذه ، من الممكن تشريح الضفيرة المشيمية من البطينين في الدماغ مع احتواء وظيفتها وصلاحيتها وهيكلها دون تلويث الضفيرة المشيمية بالأنسجة المحيطة. تتمثل إحدى العقبات المهمة في عزل الضفيرة المشيمية في تحديد البنية لأنها لا تزال تطفو في بطينات الدماغ.
تلطيخ الضفيرة المشيمية مع بروموفينول الأزرق يسهل العزل. سيوضح الإجراء إليان فان وونترجيم ، مدير مختبرنا. ابدأ بإعداد مخدر طرفي ، محلول نضح عبر القلب ، وحل مطلوب لمسح المجهر الإلكتروني ، أو SEM ، وحلول أخرى كما هو مذكور في النص.
لعزل دماغ الفأر ، ضع الحيوان المخدر الميؤوس من شفائه في وضع الاستلقاء الظهري ، وقم بتثبيت الفأر عن طريق تثبيت الأطراف على طبق. تطهير الصدر عن طريق رش 70٪ من الإيثانول قبل إجراء شق يبلغ حوالي أربعة سنتيمترات أسفل الحجاب الحاجز مباشرة باستخدام شفرة جراحية من الفولاذ الكربوني. افتح الجلد وكشف الصدر باستخدام مقص جراحي.
قطع الحجاب الحاجز مفتوحا تماما وفصل الصدر لكشف الرئتين والقلب النابض. باستخدام مضخة التروية ، قم بتهوية الماوس ب 10 ملليلتر من محلول التروية بمعدل 4.5 ملليلتر في الدقيقة. أدخل إبرة قياس 26 في البطين الأيسر لضخ المحلول في الدائرة الجهازية.
باستخدام المقص الجراحي ، قم بقطع الأذين الأيمن لخروج الدم من الدورة الدموية. بعد قطع رأس الفأر ، قم بفتح فروة الرأس عن طريق إجراء شق يبدأ بين الأذنين إلى أعلى من العينين. اسحب الجلد بشكل جانبي لكشف الجمجمة.
ثم اقطع الجمجمة باتباع الغرز الحرشفية باتجاه الجزء الأنفي. بمجرد الانتهاء من ذلك ، ضع الدماغ في طبق بتري بارد مثلج ، وأضف ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني بارد مثلج إلى أنسجة المخ. لعزل الضفيرة المشيمية العائمة في البطين الرابع ، قم بقطع المخيخ برفق عن المخ باستخدام مشرط.
إزالة أجزاء أنسجة جذع الدماغ المتبقية من المخيخ. قم بتدوير الدماغ بحيث يكون خط القطع متجها لأعلى ، مع التأكد من أن تجويف البطين الرابع مرئي في منتصف القسم مع وجود الضفيرة المشيمية في الموقع الظهري. إذا لزم الأمر ، افتح البطين عن طريق سحب النسيج الضام بملقط حاد.
تمزيق الضفيرة المشيمية برفق من جدار البطين باستخدام ملقط حاد صغير. لعزل الضفيرة المشيمية عن البطين الجانبي ، قم بقطع الدماغ سهميا إلى نصفي الكرة الأرضية باستخدام ملقط حاد صغير. قم بتدوير نصف كرة دماغي واحد بحيث يكون خط القطع لأعلى.
للكشف عن البطين الجانبي ، اسحب القشرة برفق بعيدا عن المهاد. اسحب الحصين إلى خط القطع السهمي المتوسط. يمكن الآن رؤية البطين الجانبي مع وجود الضفيرة المشيمية في أسفل البطين.
إذا لزم الأمر ، افتح البطين قليلا عن طريق سحب النسيج الضام بملقط حاد. استخدم ملقط حاد صغير لتمزيق الضفيرة المشيمية برفق من جدار البطين. لإجراء تحضير العينة ل SEM ، قم بنقل الضفيرة المشيمية المعزولة حديثا إلى محلول تثبيت طازج واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، اغسل العينة ثلاث مرات باستخدام ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من 0.1 مولار كاكوديلات الصوديوم العازلة لمدة خمس دقائق لكل منها. قم بإصلاح العينات في ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من رابع أكسيد الأوزميوم 2٪ في 0.1 مول كاكوديلات الصوديوم لمدة 30 دقيقة. ثم اغسل العينات ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من الماء عالي النقاء.
بعد ذلك ، قم بتجفيف العينات في سلسلة متزايدة من تركيزات الكحول الإيثيلي البارد المثلج مع 15 دقيقة لكل محلول كحول إيثيلي. استخدم مجفف النقاط الحرجة لتجفيف العينة بشكل صحيح. ضع العينة بعناية على حامل عينة بملصق كربوني وتصور عينات الضفيرة المشيمية باستخدام SEM.
سهل البروتوكول الحالي العزل الفعال للضفيرة المشيمية من البطينين الجانبي والرابع في دماغ الفأر. أدى التروية مع البروموفينول الأزرق إلى تصور الضفيرة المشيمية. عندما لم يسمح بالبروموفينول الأزرق في خطوات المعالجة الإضافية ، تم إجراء التروية باستخدام PBS-heparin أو عدم إجراء التروية للمعالجة.
يظهر التحليل المورفولوجي SEM لسطح خلايا الضفيرة المشيمية الظهارية ، أو CPE ، بوضوح بنية ذراعي البطين الرابع والشكل النموذجي على شكل C للضفيرة المشيمية الجانبية المعزولة عن البطين الجانبي. كشف تكبير SEM الأعلى عن هياكل تشبه الحويصلة على الجانب القمي لخلايا CPE والزغابات الدقيقة ، مما يشير إلى أنه يمكن التحقيق في التغيرات المورفولوجية لخلايا CPE في حالات المرض باستخدام SEM. من المهم لمس وإخراج أنسجة الضفيرة المشيمية فقط حتى لا تلوث العينة بالأنسجة المحيطة.
توخي الحذر اللازم للحفاظ على بنية الضفيرة المشيمية. يمكن تطبيق مجموعة متنوعة من تقنيات المصب على الضفيرة المشيمية المعزولة للتحقيق في هيكلها ووظيفتها ، بدءا من تحليل المجهر على تحليل النسخ إلى قياس التدفق الخلوي. يسمح لنا التشريف المجهري للضفيرة المشيمية خارج الدماغ بالحصول على رؤية أفضل لبنية ووظيفة نسيج المخ الصغير هذا.
هذه المعرفة ضرورية لفهم دورها في الأمراض العصبية بشكل أفضل.
