Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

맥락막 신경총의 구성과 구조에 대한 더 나은 통찰력을 얻으려면 뇌실에서 맥락막 신경총을 분리하는 효율적인 방법이 첫 번째 중요한 단계입니다. 이 미세 해부 기술을 사용하면 맥락막 신경총을 주변 조직으로 오염시키지 않고 기능, 생존력 및 구조를 포함하면서 뇌실에서 맥락막 신경총을 해부할 수 있습니다. 맥락막 신경총 분리의 중요한 장애물은 여전히 뇌실에 떠 있는 구조를 식별하는 것입니다.

맥락막 신경총을 브로 모 페놀 블루로 염색하면 분리가 용이합니다. 절차를 시연하는 것은 실험실 관리자인 Elien Van Wonterghem이 될 것입니다. 말단 마취제, 경심 관류 용액, 주사 전자 현미경 또는 SEM 및 텍스트에 언급 된 기타 용액에 필요한 용액을 준비하는 것으로 시작하십시오.

쥐의 뇌를 분리하려면 말기 마취 된 동물을 등쪽 욕창 위치에 놓고 팔다리를 판에 고정하여 마우스를 고정시킵니다. 탄소강 수술용 칼날을 사용하여 횡격막 바로 아래 약 4cm를 절개하기 전에 70% 에탄올을 분사하여 가슴을 소독합니다. 피부를 열고 수술 용 가위로 가슴을 노출시킵니다.

횡격막을 완전히 자르고 흉부를 분리하여 폐와 박동하는 심장을 노출시킵니다. 관류 펌프를 사용하여 마우스를 분당 4.5 밀리리터의 속도로 10 밀리리터의 관류 용액으로 심근 관류한다. 좌심실에 26게이지 바늘을 삽입하여 용액을 전신 회로로 펌핑합니다.

수술 용 가위를 사용하여 혈액이 순환하지 않도록 오른쪽 심방을 자릅니다. 마우스를 참수한 후 귀 사이부터 눈까지 절개하여 두피를 절개한다. 피부를 옆으로 당겨 두개골을 노출시킵니다.

그런 다음 편평 봉합사를 따라 코 부분을 향해 두개골을 자릅니다. 완료되면 뇌를 얼음처럼 차가운 페트리 접시에 넣고 얼음처럼 차가운 PBS 1 밀리리터를 뇌 조직에 첨가하십시오. 제 4 뇌실에 떠있는 맥락막 신경총을 분리하려면 메스를 사용하여 대뇌에서 소뇌를 부드럽게 잘라냅니다.

소뇌에서 나머지 뇌간 조직 부분을 제거하십시오. 절단선이 위쪽을 향하도록 뇌를 회전시켜 맥락막 신경총이 등쪽 부위에 놓여 있는 섹션 중앙에 제4심실강이 보이도록 합니다. 필요한 경우 날카로운 집게로 결합 조직을 당겨 심실을 엽니 다.

작고 날카로운 집게를 사용하여 맥락막 신경총을 심실 벽에서 부드럽게 찢습니다. 맥락막 신경총을 외측 심실에서 분리하려면 작고 날카로운 집게를 사용하여 뇌를 두 개의 반구로 시상적으로 자릅니다. 절단선이 위쪽이 되도록 한쪽 뇌 반구를 회전합니다.

외측 심실을 드러내려면 시상에서 피질을 부드럽게 잡아 당깁니다. 해마를 중간 시상 절단선으로 후퇴시킵니다. 외측 심실은 이제 맥락막 신경총이 심실의 바닥에 놓여 있는 상태에서 볼 수 있습니다.

필요한 경우 날카로운 집게로 결합 조직을 당겨 심실을 약간 엽니 다. 작고 날카로운 집게를 사용하여 맥락막 신경총을 심실 벽에서 부드럽게 찢습니다. SEM을 위한 샘플 준비를 수행하기 위해 새로 분리된 맥락막 신경총을 새로 만든 고정 용액으로 옮기고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

완료되면 3-5 밀리리터의 0.1 몰 나트륨 카코딜레이트 완충액을 사용하여 각각 5 분 동안 샘플을 3 회 세척합니다. 30분 동안 0.1몰 나트륨 카코딜레이트 완충액에 3-5밀리리터의 2% 사산화오스뮴에 샘플을 고정합니다. 그런 다음 3-5 밀리리터의 초순수를 사용하여 각각 5 분 동안 샘플을 3 회 세척하십시오.

다음으로, 에틸 알코올 용액 당 15 분으로 일련의 얼음처럼 차가운 에틸 알코올 농도로 샘플을 탈수시킵니다. 임계점 건조기를 사용하여 샘플을 적절하게 건조시킵니다. 탄소 스티커가 있는 검체 마운트에 샘플을 조심스럽게 배치하고 SEM을 사용하여 맥락막 신경총 샘플을 시각화합니다.

현재 프로토콜은 마우스 뇌, 측면 및 제4뇌실에서 맥락막 신경총의 효율적인 분리를 촉진했습니다. 브로모페놀 블루를 사용한 관류는 맥락막 신경총의 시각화를 가져왔습니다. 추가 처리 단계에서 브로모페놀 블루가 허용되지 않는 경우 PBS-헤파린으로 관류하거나 관류하지 않고 처리를 수행했습니다.

맥락막 신경총 상피 (CPE) 세포의 표면에 대한 SEM 형태 학적 분석은 제 4 뇌실의 두 팔 구조와 외측 심실에서 분리 된 외측 맥락막 신경총의 전형적인 C 자형 형태를 명확하게 보여줍니다. 더 높은 SEM 배율은 CPE 세포 및 미세융모의 정점 쪽에 소포 유사 구조를 나타냈으며, 이는 질병 상태에서 CPE 세포의 형태학적 변화를 SEM을 사용하여 조사할 수 있음을 나타냅니다. 샘플을 주변 조직으로 오염시키지 않기 위해 맥락막 신경총 조직 만 만지고 꺼내는 것이 중요합니다.

맥락막 신경총의 구조를 보존하기 위해 필요한주의를 기울이십시오. 분리된 맥락막 신경총에 다양한 다운스트림 기술을 적용하여 전사체 분석에 대한 현미경 분석에서 유세포 분석에 이르기까지 구조와 기능을 조사할 수 있습니다. 맥락막 신경총을 뇌에서 미세 해부하면 이 작은 뇌 조직의 구조와 기능에 대한 더 나은 통찰력을 얻을 수 있습니다.

이 지식은 신경계 질환에서의 역할을 더 잘 이해하는 데 필수적입니다.