Koroid pleksusun bileşimi ve yapısı hakkında daha iyi bir fikir edinmek için, koroid pleksusu beyin ventriküllerinden izole etmek için etkili bir yöntem ilk paha biçilmez bir adımdır. Bu mikrodiseksiyon tekniği ile koroid pleksusu beyin ventriküllerinden dışarı çıkarırken, koroid pleksusu çevreleyen doku ile kirletmeden fonksiyonunu, canlılığını ve yapısını içerecek şekilde diseke etmek mümkündür. Koroid pleksus izolasyonundaki önemli bir engel, yapıyı hala beyin ventriküllerinde yüzerken tanımlamaktır.
Koroid pleksusun bromofenol mavisi ile boyanması izolasyonu kolaylaştırır. Prosedürü gösteren, laboratuvar yöneticimiz Elien Van Wonterghem olacaktır. Bir terminal anestezik, transkardiyal perfüzyon çözeltisi ve elektron mikroskobu veya SEM ve metinde belirtildiği gibi diğer çözeltileri taramak için gerekli bir çözelti hazırlayarak başlayın.
Fare beynini izole etmek için ölümcül anestezi altındaki hayvanı dorsal decubitus pozisyonuna yerleştirin ve uzuvları bir tabağa sabitleyerek fareyi sabitleyin. Karbon çelik cerrahi bıçak kullanarak diyaframın hemen altında yaklaşık dört santimetrelik bir kesi yapmadan önce% 70 etanol püskürterek göğsü dezenfekte edin. Cildi açın ve cerrahi makas kullanarak göğsü açığa çıkarın.
Akciğerleri ve atan kalbi açığa çıkarmak için diyaframı tamamen açın ve göğüs kafesini ayırın. Bir perfüzyon pompası kullanarak, fareyi dakikada 4,5 mililitre oranında 10 mililitre perfüzyon çözeltisi ile transkardiyal olarak perfüze edin. Çözeltiyi sistemik devreye pompalamak için sol ventriküle 26 gauge'lik bir iğne yerleştirin.
Cerrahi makas kullanarak, kanın dolaşımdan çıkması için sağ atriyumu kesin. Farenin kafası kesildikten sonra kulakların arasından başlayarak gözlerden üstünlüğe doğru bir kesi yaparak kafa derisini kesin. Kafatasını açığa çıkarmak için cildi yanal olarak çekin.
Daha sonra burun kısmına doğru skuamozal dikişleri takip ederek kafatasını kesin. İşiniz bittiğinde, beyni buz gibi soğuk bir Petri kabına yerleştirin ve beyin dokusuna bir mililitre buz gibi PBS ekleyin. Dördüncü ventrikülde yüzen koroid pleksusu izole etmek için, bir neşter kullanarak beyinciği beyincikten yavaşça kesin.
Kalan beyin sapı doku parçalarını beyincikten çıkarın. Beyni, kesme çizgisi yukarı bakacak şekilde döndürün, dördüncü ventrikül boşluğunun, dorsal bölgede yatan koroid pleksus ile bölümün ortasında görünür olmasını sağlayın. Gerekirse, bağ dokusunu keskin forsepslerle çekerek ventrikülü açın.
Koroid pleksusu küçük keskin forsepsler kullanarak ventrikül duvarından yavaşça yırtın. Koroid pleksusu lateral ventrikülden izole etmek için, küçük keskin forsepsler kullanarak beyni sagittal olarak iki yarım küreye bölün. Bir beyin yarımküresini, kesme çizgisi yukarı doğru olacak şekilde döndürün.
Lateral ventrikülü ortaya çıkarmak için korteksi talamustan yavaşça çekin. Hipokampüsü orta sagital kesme hattına geri çekin. Lateral ventrikül artık ventrikülün dibinde yatan koroid pleksus ile görülebilir.
Gerekirse, bağ dokusunu keskin forsepslerle açarak ventrikülü biraz açın. Koroid pleksusu ventrikül duvarından nazikçe koparmak için küçük keskin forseps kullanın. SEM için numune hazırlığını gerçekleştirmek için, taze izole edilmiş koroid pleksusu taze yapılmış fiksasyon çözeltisine aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
İşiniz bittiğinde, numuneyi her biri beş dakika boyunca üç ila beş mililitre 0.1 molar sodyum kakodilat tamponu kullanarak üç kez yıkayın. Numuneleri üç ila beş mililitre% 2 osmiyum tetroksit içinde 0.1 molar sodyum kakodilat tamponunda 30 dakika bekletin. Daha sonra numuneleri her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın, üç ila beş mililitre ultra saf su kullanın.
Daha sonra, numuneleri artan bir dizi buz gibi soğuk etil alkol konsantrasyonunda, etil alkol çözeltisi başına 15 dakika ile kurutun. Numuneyi düzgün bir şekilde kurutmak için kritik bir nokta kurutucu kullanın. Numuneyi karbon etiketli bir numune montajına dikkatlice yerleştirin ve SEM kullanarak koroid pleksus numunelerini görselleştirin.
Mevcut protokol, koroid pleksusun fare beyninden, lateral ve dördüncü ventriküllerden etkili bir şekilde izole edilmesini kolaylaştırmıştır. Bromofenol mavisi ile yapılan perfüzyon, koroid pleksusun görüntülenmesi ile sonuçlandı. Daha sonraki işlem adımlarında bromofenol mavisine izin verilmediğinde, PBS-heparin ile perfüzyon yapıldı veya işleme için perfüzyon yapılmadı.
Koroid pleksus epitelyal veya CPE hücrelerinin yüzeyinin SEM morfolojik analizi, dördüncü ventrikülün iki kol yapısını ve lateral ventrikülden izole edilen lateral koroid pleksusun tipik C şeklindeki formunu açıkça göstermektedir. Daha yüksek bir SEM büyütmesi, CPE hücrelerinin ve mikrovillusların apikal tarafında vezikül benzeri yapılar ortaya çıkardı, bu da CPE hücrelerinin hastalık koşullarındaki morfolojik değişikliklerinin SEM kullanılarak araştırılabileceğini gösterdi. Numuneyi çevreleyen doku ile kirletmemek için sadece koroid pleksus dokusuna dokunmak ve çıkarmak önemlidir.
Koroid pleksusun yapısını korumak için gerekli dikkati kullanın. İzole koroid pleksusun yapısını ve işlevini araştırmak için mikroskop analizinden transkriptom analizine ve akış sitometrisine kadar çeşitli aşağı akış teknikleri uygulanabilir. Koroid pleksusun beyinden mikrodiseksiyonu, bu küçük beyin dokusunun yapısı ve işlevi hakkında daha iyi bir fikir edinmemizi sağlar.
Bu bilgi, nörolojik hastalıklardaki rolünü daha iyi anlamak için gereklidir.
