اعتمدت أبحاث العين في الأوقات السابقة في الغالب على أنسجة العين من الأفراد المتوفين. ومع ذلك ، على مر السنين ، تم تطوير العديد من نماذج القوارض العينية وتضاءلت الحاجة إلى أنسجة العين البشرية. نظرا لصغر حجمها ومحدودية مساحة العمليات في عين القوارض ، فإن الوصول الفعال إلى الأجزاء الفرعية للعين مقيد بشدة.
عادة ، للعمل على عين القوارض ، يتم تجميد العين عن طريق العصب البصري ويتم إجراء التشريح. هذه الممارسة شاقة ويمكن أن تلحق الضرر بالأنسجة الهشة حيث تستمر العين الكروية في التحرك أثناء التشريح. على الرغم من كونها مفيدة في عزل الأقسام المختلفة لطبقات الشبكية ، إلا أن هذه التقنية لا يمكنها تحديد الاتجاه المكاني للأنسجة عند تشريح الأنسجة.
علاوة على ذلك ، من الصعب تحديد موقع التدخل المستهدف بعد التشريح بسبب التجمع الخلوي المتجانس لكأس العين الخلفي والأمامي. في هذا الفيديو ، يتم عرض طريقة جراحية معدلة للتشريح المجهري. يقدم وجود الغشاء المرفق ، أو الجفن الثالث ، مزايا فريدة ومهمة.
في هذه الطريقة ، يتم أولا استئصال مقلة العين بالجفن الثالث ، ثم يتم استخدام الجفن الثالث لشل حركة العين. يتبعه ثقب مقلة العين من خلال ليمبوس القرنية ، ويتم استخدام الشق كنقطة دخول. ثم ، عن طريق قطع على طول المحيط ، يتم فصل أكواب العين الأمامية والخلفية.
من خلال تشريح كوب العين الخلفي بشكل أكبر ، يتم تحديد الطبقة الشفافة من الشبكية العصبية وتقشيرها بلطف. وبالتالي يتم الحصول على الطبقات العصبية و RPE لمزيد من المعالجة. سيمكننا الجفن الثالث من تحديد الاتجاه المكاني لاستئصال العين بعد الاستئصال.
دعونا الآن نتبع الإجراء التفصيلي خطوة بخطوة. تمدد عيون القوارض باستخدام قطرة من 0.8 ٪ تروبيكاميد و 5 ٪ من محاليل العيون فينيليفرين ووضع الحيوان في منطقة مظلمة لمدة 30 دقيقة قبل العملية. القتل الرحيم للحيوان عن طريق إعطاء جرعات التخدير خمس مرات داخل الصفاق.
الجرعة النموذجية هي 200 ميكرولتر PBS تحتوي على 10 ملغ من الكيتامين وواحد من الزيلازين. تأكد من عدم الاستجابة الكاملة للتحفيز من خلال فحص منعكس الدواسة. ضع الماوس في الاستلقاء الجانبي للسماح بالوصول الكامل إلى العين.
احتفظ بملقط خياطة كوليبري ، وملقط منحني ، وشفرة صغيرة بحجم 15 درجة وثلاثة ملليمترات ، ومقص زنبركي صغير ، ومقص صغير بزاوية جاهزة للإجراء. ضع ملقط منحني حول مقلة العين واضغط لتحرير العين من المرفقات الدخيلة. يقع الجفن الثالث ، المعروف أيضا باسم الغشاء النخاعي ، باتجاه الزاوية العليا من الظل الأنفي ويمكن تحديده على أنه نتوء شفاف ثانوي مع حدود مصطبغة.
بعد ذلك ، استخدم مقصا صغيرا زنبركيا وقطعه حول مقلة العين. تعمل الجروح الصغيرة المستمرة على تحرير مقلة العين من ملحقات الصلبة. ضع مقصا صغيرا زنبركيا منحنيا تحت مقلة العين لتحرير العين عن طريق قطع العصب البصري.
ضع العين المنزوعة النواة في طبق بتري يحتوي على مخزن مؤقت ل PBS بحيث يتم غمر مقلة العين في برنامج تلفزيوني. ستبدأ بعض العضلات أو الأنسجة خارج العين في الطفو بعيدا عن مقلة العين. قم بإزالتها عن طريق قطعها عن مقلة العين باستخدام مقص زنبركي صغير.
بعد ذلك ، قم بإزالة العصب البصري من قاعدة مقلة العين للسماح بفصل أفضل للشبكية للاستعدادات الكاملة. ليس من الضروري إزالة العصب البصري لتقسيم الأنسجة. نقل مقلة العين إلى أنبوب 1.5 مل يحتوي على مل واحد من 4٪ بارافورمالدهيد أو PFA.
احتفظ بها لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية لتثبيت الأنسجة. من الممكن التوقف عند هذه الخطوة عن طريق ترك الأنسجة في PFA لمدة تصل إلى 12 ساعة عند أربع درجات مئوية. ومع ذلك ، لعزل الخلايا الحية ، لا ينبغي تنفيذ خطوات التثبيت ويجب تنفيذ الإجراء بأكمله بشكل مستمر.
بعد تثبيت PFA ، انقل مقلة العين إلى طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني وضعه تحت مجهر تشريح لتنفيذ الإجراء اللاحق. شل حركة مقلة العين عن طريق الضغط باستمرار على الجفن الثالث بإحكام باستخدام ملقط كوليبري للخياطة. الحافة هي تقاطع القرنية الصلبة.
قم بعمل شق صغير في الحافة عن طريق ثقبه باستخدام شفرة صغيرة. يفضل إجراء شق مقابل الجفن الثالث. بعد ذلك ، باستخدام هذا الشق كنقطة انطلاق ، باستخدام المقص الدقيق ، قم بعمل جروح صغيرة ومستمرة على طول محيط الحافة الصلبة للقرنية.
أولا ، أكمل نصف دائرة من الجروح بدءا من نقطة الشق حتى الجفن الثالث. ثم أكمل نصف الدائرة المتبقية من التخفيضات على الجانب الآخر. أخيرا ، قم بعمل قطع حول الجفن الثالث لفصل الكأس الخلفي والأمامي.
قم بإزالة العدسة من الكأس الخلفي باستخدام ملقط للحصول على الكأس الخلفي المكون من الشبكية العصبية وطبقة RPE والكأس الأمامية للقرنية. في حالة العمل مع الأنسجة غير الثابتة ، يمكن الآن هضم الكؤوس الأمامية والخلفية إنزيميا للحصول على تعليق القرنية أو الشبكية أحادي الخلية. لتثبيت الأنسجة ، انقل هذه الأكواب إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من 4٪ PFA لمدة 12 ساعة عند أربع درجات مئوية.
بعد التثبيت ، يمكن تضمين الأنسجة في وسط مناسب ويمكن إجراء التقسيم بالتبريد أو تقسيم البارافين للحصول على أقسام القرنية أو الشبكية. أعد إدخال الكوب الخلفي في طبق بتري الذي يحتوي على مخزن مؤقت PBS. الطبقة المعتمة على طبقة RPE المصطبغة هي الشبكية العصبية.
انزع الشبكية العصبية باستخدام ملقط ثان. يوصى بشدة بحركة يد لطيفة وخفيفة للغاية حتى لا تتلف الأنسجة. عند العصب البصري ، يمكن إدخال مقص الزنبرك المنحني تحت الشبكية العصبية ، ويمكن إجراء قطع لتحرير الطبقات تماما إذا ظلت الشبكية العصبية متصلة.
يمكن أيضا تحرير شبكية العين أو فصلها عن طريق التمسيد بها برفق بفرشاة ناعمة. أعد إدخال الأكواب الأمامية والخلفية في طبق بتري الذي يحتوي على مخزن مؤقت PBS. استخدم مقصا صغيرا بزاوية زنبركية لعمل قطع بجوار الجفن الثالث من المحيط بشكل عمودي باتجاه المركز البصري.
الحفاظ على قبضة الجفن الثالث وجعل قطع بجانب القطع الأول. قم بعمل قطع مماثل بين القطع الثاني والجفن الثالث. ثلاثة أو أربعة قطع متساوية البعد تفتح الكؤوس نصف الكروية على شكل زهرة ، والتي تسقط بشكل مسطح ويمكن تركيبها بسهولة.
لا تقم بعمل جروح عميقة جدا حتى مركز الكوب ، لأن هذا قد يجعل أقسام الأوراق تنهار أو تنفصل بسهولة. يسمح الوسط السائل لكوب العين الأمامي بالوصول إلى بنية منحنية. اتبع نفس الخطوات المعطاة لإجراء جروح على الكوب الخلفي لإجراء ثلاث أو أربع جروح متساوية البعد على الكوب الأمامي.
الأنسجة جاهزة الآن لمزيد من التلطيخ. في هذا الشكل، يوضح الكوب الأمامي بالكامل. تم تشريح أنسجة القرنية كما هو موضح للكشف عن الأوعية اللمفاوية في نسيج الملتحمة المرفق بنشرة القرنية.
في هذا الشكل، يوضح الشكل الشبكية العصبية بالكامل. كانت الأوعية الدموية في شبكية العين العصبية ملطخة ب Isolectin ويمكن رؤيتها كأوعية خضراء. في هذه الطريقة ، يتم الحصول على مقلة العين المنزوعة النواة للفئران مع الجفن الثالث المرفق للتعامل الفعال والسهل.
الجفن الثالث يجمد مقلة العين تماما ويسمح للتشريح بالمضي قدما بسهولة وبأقل قدر من الأخطاء. هذه الطريقة مفيدة للتقسيم الخاص بأنسجة العين ، وتحليل الخلية الواحدة ، والتركيب الكامل. ومع ذلك ، فإن الحاجة إلى تثبيت الأنسجة المتكررة تجعل الأنسجة غير قابلة للحياة لزراعة الخلايا أو ضرورات الخلايا الحية هذه.
ومن ثم ، يجب تنفيذ الإجراء في سلسلة متصلة لعزل الخلايا الحية.
