يوفر هذا النموذج فرصا تجريبية لدراسة الجوانب المختلفة لميالين الجهاز العصبي المحيطي في المختبر. إنه يتيح القياس الكمي للمايلين وفحص تفاعلات خلايا Axon-Schwann. تطور الثقافة المشتركة ميالين قويا من اليوم 14 فصاعدا.
توفر الثقافات المزروعة DRG ميزة العمارة الهيكلية السليمة مقارنة بالثقافات العصبية المنفصلة. هذه الطريقة متاحة للكشف عن المركبات الاستوائية للأمراض الالتهابية والتنكسية العصبية في الجهاز العصبي المحيطي. للبدء ، تعقيم منطقة العمل في جذع الفئران القتل الرحيم مع 70 ٪ من الإيثانول.
افتح الطرف الأيسر السفلي الظهري للفأر بالمقص ، وقم بإزالة العضلة الفخذية للعضلة ذات الرأسين بعناية. قم بفك العصب الوركي عن طريق الارتفاع السلس بالملقط المنحني ، مع ضمان عدم كدمات العصب. باستخدام ملقط ، انقل الأعصاب المقطوعة إلى طبق زراعة الأنسجة مع وسط L-15 البارد من Leibovitz مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الجنتاميسين.
ثم ، باستخدام مجهر ستيريو ، قم بإزالة الدهون والعضلات والأوعية الدموية من الأعصاب باستخدام زوجين من الملقط الدقيق. حدد الأطراف القريبة والبعيدة للعصب الوركي وقم بإزالة العصب العلوي بزوج واحد من الملقط الرفيع في الاتجاه القريب إلى البعيد مع إمساك نهاية العصب القريب بالزوج الثاني من الملقط الدقيق. بعد نقل الأعصاب النقية إلى طبق آخر لزراعة الأنسجة مع وسط L-15 البارد من Leibovitz مع Gentamycin ، ندف الحزم العصبية المعزولة لفصل وعزل الألياف العصبية المفردة باستخدام زوجين من الملقط الدقيق.
انقل الألياف العصبية إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر ، وتناول أقل قدر ممكن من الوسط. ثم أضف 50 ملليلتر من وسط Leibovitz's L 15 مع الجنتاميسين إلى الألياف العصبية عدة مرات. جهاز طرد مركزي الأنبوب الذي يحتوي على الألياف العصبية عند 188 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
بعد إزالة المادة الطافية ، انقل الحبيبات مع وسيط Leibovitz L-15 المتبقي إلى طبق زراعة الأنسجة 60 ملم. شطف أنبوب 50 ملليلتر مع 10 ملليلتر من محلول الهضم الأنزيمي وإضافته إلى طبق الألياف العصبية. توزيع الألياف العصبية في الطبق بعناية مع طرف ماصة.
احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 18 ساعة. ووقف الهضم الأنزيمي عن طريق إضافة 10 ملليلتر في 40٪ FCS في HBSS. نقل الأعصاب المهضومة إلى أنبوب 50 ملليلتر إلى جهاز طرد مركزي عند 188 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من DMEM تحتوي على 10٪ FCS و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الجنتاميسين. بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر. بعد الطرد المركزي عند 188 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، أعد تعليق الحبيبات بأربعة ملليلتر من DMEM تحتوي على FCS و gentamycin.
أضف ملليلتر من معلق الخلية إلى كل من أطباق زراعة الأنسجة المغلفة بالبوليسين واللامينين 60 ملم. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون ، وترك لوحات دون أن يمسها لمدة يومين في الحاضنة. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية شوان عند 188 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وإعادة تعليق بيليه الخلية في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفصل الخلايا المغناطيسية لكل واحد في 10 إلى الخلايا السابعة.
ثم أضف 10 ميكرولتر من حبات ti1 الصغيرة لكل مرة 10 إلى الخلايا السابعة. احتضان المحلول المعلق لمدة 15 دقيقة في الظلام عند ثماني درجات مئوية. بعد ذلك ، أضف ملليلتر في المخزن المؤقت لفصل الخلايا المغناطيسية إلى تعليق الخلية.
بعد الطرد المركزي عند 300 جيجا لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفصل الخلايا المغناطيسية. ضع عمود فصل الخلايا المغناطيسية في فاصل الخلايا ، ورطب العمود بملليلتر واحد من المخزن المؤقت لفصل الخلايا المغناطيسية. ثم قم بتطبيق الخلايا عليها لجمع التدفق من خلال الطرد المركزي.
قم بإزالة الرحم بعناية من الفئران الحامل الرحيمة ووضعه في طبق زراعة الأنسجة 100 ملم مع HBSS البارد المثلج. عقد الرحم باستخدام ملقط منحني ، وفتح جدار الرحم مع ملقط غرامة. قم بإزالة كيس أمنيوسي واحد وافتحه بعناية عن طريق قرص ثقب بالملقط الرفيع.
قم بإزالة جميع الأجنة بسرعة من الرحم ونقلها إلى طبق مليء ب HBSS. برفق ، ضع جذع جنين واحد في طبق 35 ملم مملوء ب HBSS. تحت مجهر ستيريو ، افتح الجزء الظهري من الجذع لتقسيم الجنين إلى نصفين.
أدر نصفا إلى الجانب وحدد حبلا العقد الجذرية الظهرية ، أو DRG ، الموجودة في الخط الموجود في الجزء الظهري من الجنين. اقطع DRG كخصلة كاملة باستخدام ملقط ناعم ومقص صغير. بعد وضع DRG في طبق طازج مملوء بمليلتر من HBSS ، افصل DRG واحدا عن الأنسجة المتبقية باستخدام ملقط دقيق ومقص صغير.
خذ صفيحة 4 آبار تحتوي على 190 ميكرولتر من وسط نمو DRG في كل بئر ، وانقل DRG واحدا بعناية إلى وسط كل بئر باستخدام ملقط دقيق وملعقة. ثم ضع مزارع DRG في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، أضف بعناية 50 ميكرولترا من وسط نمو DRG إلى كل بئر ولاحظ التصاق DRG ونمو المحور باستخدام المجهر يوميا.
للزراعة المشتركة في اليوم الثالث من زراعة DRG ، استبدل بعناية وسط نمو DRG ب 250 ميكرولتر من وسط الاستزراع المشترك الذي يحتوي على 30،000 خلية شوان لكل بئر. لإجراء تلطيخ كيميائي مناعي ، قم بتثبيت الخلايا الموجودة على زلات الغطاء عن طريق احتضان الخلايا المغسولة DPBS في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق. التقط صورا للعينات الملطخة كيميائيا في ثماني مناطق محددة تحيط بمصنع DRG في المركز باستخدام مجهر مقلوب.
يصور هنا مظهر خلايا شوان ذات مورفولوجيا ممدودة وشكل مغزل ومحاور DRG الرفيعة في ثقافة مشتركة. تم تقييم الميالين في الثقافة المشتركة في أيام مختلفة عن طريق تلطيخ نباتات DRG وخلايا شوان لبروتين المايلين الأساسي أو MBP ، وبيتا ثلاثة توبولين ، و DAPI. كانت الشبكة المحورية في الثقافة المشتركة كثيفة ، ولم تتغير بشكل واضح في المسار الزمني للملاحظة.
كانت العلامات الأولى للميالين مرئية في اليومين 10 و 12 من الثقافة المشتركة. من اليوم 14 ، كانت إشارة MVP أكثر وضوحا ، وتم اكتشاف محاور مغلفة بالمايلين. زاد الميالين مع وقت الاستزراع المشترك حتى اليوم 20.
تم قياس الميالين كنسبة من MVP وبيتا ثلاث مناطق إيجابية توبولين. لوحظت زيادة كبيرة في الميالين في اليومين 18 و 20 مقارنة باليوم 10. ثقافات زراعة DRG هشة ، وتحتاج إلى التعامل معها بعناية.
على سبيل المثال ، عند إخراجها من الحاضنة أو أثناء التغيير المتوسط والتثبيت. يمكن تشكيل تحليل التعبير الجيني لعينات الثقافة المشتركة لدراسة المايلين بمزيد من التفصيل. هنا ، اكتشفنا علامات المايلين PMP22 و MAG و Oct6 و Egr2 و Olig1 في اليوم 22.
