Данная модель предоставляет экспериментальные возможности для изучения различных аспектов миелинизации периферической нервной системы in vitro. Это позволяет количественно определять миелин и исследовать взаимодействия аксон-шванновских клеток. Совместная культура развивает устойчивую миелинизацию с 14-го дня.
Культуры эксплантатов DRG обеспечивают преимущество интактной структурной архитектуры по сравнению с диссоциированными нейронными культурами. Этот метод доступен для скрининга тропотических соединений при воспалительных и нейродегенеративных заболеваниях периферической нервной системы. Для начала простерилизуйте рабочую зону в туловище усыпленной крысы 70% этанолом.
Вскройте ножницами спинную нижнюю левую конечность крысы и осторожно удалите бедренную мышцу бицепса. Ослабьте седалищный нерв путем плавного возвышения с помощью изогнутых щипцов, чтобы не ушибнуть нерв. Используя щипцы, перенесите обрезанные нервы в чашку для культивирования тканей с ледяной средой L-15 Лейбовица с 50 микрограммами на миллилитр гентамицина.
Затем, используя стереомикроскоп, удалите жир, мышцы и кровеносные сосуды из нервов с помощью двух пар тонких щипцов. Определите проксимальный и дистальный концы седалищного нерва и удалите эпиневрий одной парой тонких щипцов в проксимальном и дистальном направлении, удерживая проксимальный нервный конец второй парой тонких щипцов. После переноса очищенных нервов в другую чашку для культивирования тканей с ледяной средой L-15 Лейбовица с гентамицином дразните изолированные нервные пучки, чтобы разделить и изолировать отдельные нервные волокна с помощью двух пар тонких щипцов.
Перенесите нервные волокна в 50-миллилитровую трубку с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров и возьмите как можно меньше среды. Затем добавьте 50 миллилитров среды Лейбовица L 15 с гентамицином к нервным волокнам несколько раз. Центрифугируйте пробирку, содержащую нервные волокна при 188 G, в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
После удаления надосадочной жидкости перенесите гранулу с оставшейся средой L-15 Лейбовица в 60-миллиметровую чашку для культивирования тканей. Промойте 50-миллилитровую пробирку 10 миллилитрами ферментативного раствора для сбраживания и добавьте ее в посуду для нервных волокон. Аккуратно распределите нервные волокна в посуде кончиком пипетки.
Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 18 часов. И остановите ферментативное переваривание, добавив 10 миллилитров при 40% FCS в HBSS. Перенесите переваренные нервы в 50-миллилитровую пробирку в центрифугу при 188 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах DMEM, содержащем 10% FCS и 50 микрограммов на миллилитр гентамицина. Затем отфильтруйте клеточную суспензию через 100-микрометровый сетчатый фильтр. после центрифугирования при 188 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия повторно суспендировать гранулу четырьмя миллилитрами DMEM, содержащим FCS и гентамицин.
Добавьте два миллилитра клеточной суспензии в каждую из двух 60-миллиметровых чашк для культивирования тканей, покрытых полилизином и ламинином. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, оставляя пластины нетронутыми в течение двух дней в инкубаторе. Центрифугируйте суспензию шванновской ячейки при 188 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и повторно суспендируйте гранулу ячейки в 90 микролитрах магнитного буфера разделения ячеек на 10 к седьмым ячейкам.
Затем добавьте 10 микролитров микрошариков ti1 на 10 раз в седьмую ячейку. Повторно взвешенный раствор инкубировать в течение 15 минут в темноте при температуре восемь градусов Цельсия. Затем добавьте два миллилитра в буфер для разделения магнитных элементов в суспензию ячейки.
После центрифугирования при 300 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах магнитного буфера для разделения ячеек. Поместите колонну разделения магнитных ячеек в сепаратор ячеек и увлажните колонку одним миллилитром буфера разделения магнитных ячеек. Затем приложите к нему клетки, чтобы собрать поток для центрифугирования.
Осторожно извлеките матку из усыпленной беременной крысы и поместите ее в 100-миллиметровую чашку для культивирования тканей с ледяным HBSS. Удерживая матку с помощью изогнутых щипцов, вскрывайте стенки матки тонкими щипцами. Извлеките один амниотический мешок и осторожно откройте его, защипнув отверстие тонкими щипцами.
Быстро извлеките все эмбрионы из матки и перенесите их в посуду, наполненную HBSS. Аккуратно поместите туловище одного эмбриона в 35-миллиметровую посуду, наполненную HBSS. под стереомикроскопом Откройте дорсальную часть туловища, чтобы разделить эмбрион на две половины.
Поверните одну половину в сторону и определите нить ганглиев дорсальных корешков, или DRG, расположенную на линии в дорсальной части эмбриона. Вырежьте DRG как целую прядь с помощью тонких щипцов и микроножниц. Поместив DRG в свежую посуду, наполненную двумя миллилитрами HBSS, отделите один DRG от оставшейся ткани с помощью тонких щипцов и микроножниц.
Возьмите 4-луночную пластину, содержащую 190 микролитров питательной среды DRG в каждой лунке, и осторожно перенесите одну DRG в центр каждой лунки с помощью тонких щипцов и шпателя. Затем поместите культуры эксплантата DRG в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день осторожно добавьте 50 микролитров питательной среды DRG в каждую лунку и ежедневно наблюдайте за прилипанием эксплантата DRG и ростом аксонов с помощью микроскопа.
Для совместного культивирования на третий день культуры эксплантата DRG осторожно замените питательную среду DRG на 250 микролитров среды для совместного культивирования, содержащей 30 000 шванновских клеток на лунку. Для выполнения иммуноцитохимического окрашивания фиксируйте клетки на покровных листах, инкубируя промытые клетки DPBS в 4% параформальдегиде в течение 10 минут. Сфотографируйте иммуноцитохимически окрашенные образцы в восьми определенных областях, окружающих эксплантат DRG в центре, с помощью инвертированного микроскопа.
Здесь изображен внешний вид шванновских клеток с удлиненной и веретенообразной морфологией и тонкими аксонами DRG в кокультуре. Миелинизацию в кокультуре оценивали в разные дни путем окрашивания эксплантатов DRG и шванновских клеток на основной белок миелина или MBP, бета-три тубулин и DAPI. Аксональная сеть в кокультуре была плотной и не изменялась заметно во время наблюдения.
Первые признаки миелинизации были видны на 10-й и 12-й день совместной культуры. С 14-го дня сигнал ПМК был более выраженным, и были обнаружены аксоны, обернутые миелином. Миелинизация увеличивалась со временем совместной культуры до 20-го дня.
Миелинизация была количественно определена как отношение ПМК и бета-трех тубулин-положительных областей. Значительное увеличение миелинизации наблюдалось на 18-й и 20-й день по сравнению с 10-м днем. Культуры эксплантатов DRG хрупкие, и с ними нужно обращаться осторожно.
Например, при извлечении из инкубатора или во время смены среды и фиксации. Анализ экспрессии генов образцов совместной культуры может быть сформирован для более подробного изучения миелина. Здесь мы обнаружили миелиновые маркеры PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 на 22-й день.
