מודל זה מספק הזדמנויות ניסיוניות ללמוד היבטים שונים של myelination של מערכת העצבים ההיקפית במבחנה. הוא מאפשר כימות מיאלין ובחינה של אינטראקציות תאי אקסון-שואן. התרבות המשותפת מפתחת מיאלינציה חזקה מהיום ה-14 ואילך.
תרביות DRG explant מספקות את היתרון של ארכיטקטורה מבנית שלמה בהשוואה לתרבויות עצביות מנותקות. שיטה זו זמינה כדי לסנן תרכובות tropotic עבור מחלות דלקתיות נוירודגנרטיביות של מערכת העצבים ההיקפית. כדי להתחיל, לעקר את אזור העבודה בפלג הגוף העליון של החולדה המורדמת עם 70% אתנול.
פתחו את הגפה השמאלית התחתונה הגבית של החולדה בעזרת מספריים, והסירו בזהירות את שריר הזרוע. שחררו את העצב הסיאטי על ידי הגבהה חלקה עם מלקחיים מעוקלים, והקפידו לא לחבול בעצב. בעזרת מלקחיים, מעבירים את העצבים החתוכים לצלחת תרבית רקמה עם מדיום L-15 קר כקרח של לייבוביץ' עם 50 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין.
לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, הסר את השומן, השרירים וכלי הדם מהעצבים בעזרת שני זוגות מלקחיים עדינים. זהה את הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של העצב הסיאטי והסר את האפיניוריום עם זוג אחד של מלקחיים עדינים בכיוון פרוקסימלי עד דיסטלי תוך החזקת קצה העצב הפרוקסימלי עם הזוג השני של מלקחיים עדינים. לאחר העברת העצבים המטוהרים לצלחת תרבית רקמה אחרת עם מדיום L-15 קר כקרח של לייבוביץ' עם ג'נטמיצין, מקניטים את פשקווילי העצבים המבודדים כדי להפריד ולבודד סיבי עצב בודדים באמצעות שני זוגות מלקחיים עדינים.
מעבירים את סיבי העצב לצינור 50 מיליליטר באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, ותופסים כמה שפחות מדיום. לאחר מכן להוסיף 50 מיליליטר של מדיום L 15 של לייבוביץ' עם גנטמיצין לסיבי העצב ב slew כמה פעמים. צנטריפוגה הצינור המכיל את סיבי העצב ב 188 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הסרת הסופרנטנט, מעבירים את הגלולה עם התווך L-15 של לייבוביץ' לצלחת תרבית רקמה של 60 מילימטר. שוטפים את צינור ה-50 מיליליטר ב-10 מיליליטר של תמיסת העיכול האנזימטית ומוסיפים אותו לצלחת סיבי העצב. מפיצים את סיבי העצבים בצלחת בזהירות עם קצה פיפטה.
יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 18 שעות. ולעצור את העיכול האנזימטי על ידי הוספת 10 מיליליטר ב 40% FCS ב HBSS. מעבירים את העצבים המעוכלים לתוך צינור 50 מיליליטר לצנטריפוגה ב 188 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר השלכת supernatant, להשעות מחדש את הגלולה ב 10 מיליליטר של DMEM המכיל 10% FCS ו 50 מיקרוגרם למיליליטר של gentamycin. לאחר מכן, סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים 100 מיקרומטר. לאחר צנטריפוגה ב 188 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, להשעות מחדש את הגלולה עם ארבעה מיליליטר של DMEM המכיל FCS ו gentamycin.
הוסף שני מיליליטר של תרחיף התא לכל אחד משני כלי תרבית רקמה מצופים פוליליזין ולמינין 60 מילימטר. דוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, ומשאירים את הלוחות ללא מגע במשך יומיים באינקובטור. צנטריפוגו את תרחיף תאי Schwann ב 188 G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, והשהו מחדש את כדורית התא ב 90 מיקרוליטר של חיץ הפרדת תאים מגנטי לכל אחד כפול 10 לתא השביעי.
לאחר מכן להוסיף 10 מיקרוליטר של ti1 מיקרו חרוזים לכל אחד כפול 10 לתאים השביעי. לדגור על התמיסה מחדש במשך 15 דקות בחושך בשמונה מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר במאגר הפרדת התאים המגנטי לתרחיף התא.
לאחר צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, להשהות מחדש את הגלולה ב 500 מיקרוליטר של חיץ הפרדת תאים מגנטי. מקם את עמודת הפרדת התאים המגנטית במפריד התא, והרטיב את העמוד במיליליטר אחד של מאגר הפרדת התאים המגנטי. לאחר מכן להחיל את התאים על זה כדי לאסוף את הזרימה דרך צנטריפוגה.
הוציאו בזהירות את הרחם מחולדה הרה שעברה המתת חסד והניחו אותו בצלחת תרבית רקמות 100 מילימטר עם HBSS קר כקרח. מחזיק את הרחם באמצעות מלקחיים מעוקלים, לפתוח את דופן הרחם עם מלקחיים עדינים. מוציאים שק מי שפיר אחד ופותחים אותו בזהירות על ידי צביטת חור במלקחיים עדינים.
הוציאו במהירות את כל העוברים מהרחם והעבירו אותם לצלחת מלאה ב- HBSS. בעדינות, הכניסו את פלג הגוף העליון של העובר לתוך צלחת 35 מ"מ מלאה ב-HBSS. תחת מיקרוסקופ סטריאו, פתח את החלק הגבי של פלג הגוף העליון כדי לחלק את העובר לשני חצאים.
סובבו חצי אחד הצידה וזהו את גדיל גרעיני השורש הגבי, או DRG, הממוקם בקו בחלק הגבי של העובר. גזרו את ה-DRG כגדיל שלם בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים זעירים. לאחר הנחת DRG בכלי טרי מלא שני מיליליטר של HBSS, יש להפריד DRG בודד מהרקמה הנותרת באמצעות מלקחיים עדינים ומספריים זעירים.
קחו צלחת 4 בארות המכילה 190 מיקרוליטר של מדיום גידול DRG בכל באר, והעבירו בזהירות DRG בודד למרכז כל באר באמצעות מלקחיים עדינים ומרית. לאחר מכן הניחו את תרביות הצמחים של DRG באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת, הוסיפו בזהירות 50 מיקרוליטר של מצע הגידול DRG לכל באר וצפו בהיצמדות DRG וצמיחת אקסונים באמצעות מיקרוסקופ יומי.
לגידול משותף ביום השלישי של תרבית הצמחים של DRG, החלף בזהירות את מדיום הגידול של DRG ב -250 מיקרוליטר של מדיום התרבית המשותפת המכיל 30, 000 תאי שוואן לכל באר. לביצוע צביעה אימונוציטוכימית, תקן את התאים על החלקות הכיסוי על ידי דגירה של התאים שנשטפו DPBS ב 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות. צלמו את הדגימות המוכתמות אימונוציטוכימית בשמונה אזורים מוגדרים המקיפים את צמח ה-DRG במרכז באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
המראה של תאי שוואן עם מורפולוגיה מוארכת ובצורת ציר ואקסוני DRG דקים בתרבית משותפת מתואר כאן. מיאלינציה בתרבית המשותפת הוערכה בימים שונים על ידי צביעת צמחי DRG ותאי Schwann עבור חלבון בסיסי של מיאלין או MBP, בטא שלוש טובולין ו- DAPI. הרשת האקסונלית בתרבות המשותפת הייתה צפופה, ולא השתנתה באופן ניכר במהלך הזמן של התצפית.
סימנים ראשונים של מיאלינציה נראו בימים 10 ו -12 של תרבות משותפת. מהיום ה-14, אות ה-MVP היה בולט יותר, ואקסונים עטופים במיאלין זוהו. המיאלינציה גדלה עם זמן התרבות המשותפת עד היום ה-20.
המיאלינציה כומתה כיחס בין MVP ובטא שלושה אזורים חיוביים לטובולין. עלייה משמעותית במיאלינציה נצפתה בימים 18 ו-20 בהשוואה ליום 10. תרביות צמחי DRG הן שבירות, ויש לטפל בהן בזהירות.
לדוגמה, כאשר מוציאים אותם מהאינקובטור או במהלך שינוי וקיבוע בינוניים. ניתוח ביטוי גנים של דגימות תרבית משותפת יכול להיווצר כדי לחקור את המיאלין בפירוט רב יותר. כאן, זיהינו את סמני המיאלין PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 ביום ה-22.
