يمكن لبروتوكول فحص السمية الخلوية باستخدام خطوط خلايا الزرد الإجابة على الأسئلة المتعلقة بالسمية الحادة للمواد الكيميائية على الأسماك أو المساعدة في تحديد تركيزات الاختبار المناسبة لمقايسات الأسماك البديلة الأخرى. الميزة الرئيسية لفحص الصفيحة المكون من 96 بئرا هي الجمع بين نقاط نهاية مختلفة للصلاحية لتحديد السمية الخلوية لخلايا الزرد التي تعد نوعا مهما من الأسماك في دراسات السمية البيئية. البروتوكول بسيط جدا.
إذا اتبعت جميع الخطوات الموضحة بشكل صحيح ، فلا ينبغي للمرء أن يواجه أي مشكلة. يساعد هذا البروتوكول على عدم إجراء أي دراسات سمية بيئية حيوانية لتقييم التأثيرات في خطوط خلايا الأسماك المشتقة من أعضاء مختلفة أو مرحلة حياة مختلفة مثل خلايا الكبد في الخلايا الجنينية. لبدء طلاء خلايا ZEM2S أو ZFL ، احسب حجم تعليق الخلية المعني اللازم للحصول على العدد المطلوب من الخلايا للمقايسات.
املأ خزان كاشف معقم بوسط الاستزراع الكامل لخط الخلية المقابل وانقل الحجم المحسوب لتعليق الخلية إلى الخزان لحجم إجمالي قدره 20 ملليلتر. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، امزج المحلول برفق لأعلى ولأسفل دون تشكيل أي رغوة أو فقاعات. ثم باستخدام الماصة الدقيقة متعددة القنوات ، أضف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة البوليسترين الشفافة ذات 96 بئرا للحصول على عدد خلايا قابل للحياة يبلغ 60،000 خلية لكل بئر لخلايا ZEM2S و 40،000 خلية لكل بئر لخلايا ZFL.
احتضان اللوحة عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. لتعريض أي نوع من الخلايا لتركيزات مختلفة من المواد الكيميائية الاختبارية ، قم بإعداد التركيز المطلوب للمحاليل الكيميائية للاختبار في وسائط الاستزراع لخط اهتمام الخلية بدون مصل بقري جنيني أو FBS. بعد الحضانة على مدار 24 ساعة ، تخلص بعناية من الوسائط المستهلكة من الآبار باستخدام ماصة دقيقة متعددة القنوات.
ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول كيميائي اختبار معين لكل بئر في ثلاث نسخ تقنية ، مما يعني ثلاثة آبار لكل تركيز كيميائي للاختبار. ضع مجموعات التحكم على نفس اللوحة مثل المواد الكيميائية الاختبارية في ثلاث نسخ تقنية. بالنسبة للتحكم الفارغ ، أضف 100 ميكرولتر من وسائط التعرض في ثلاثة آبار خالية من الخلايا.
للتحكم السلبي ، أضف 100 ميكرولتر من وسائط التعرض إلى ثلاثة آبار تحتوي على خلايا. للتحكم الإيجابي ، قم بتعريض ثلاثة آبار تحتوي على خلايا لمحلول Triton X-100 بنسبة 1٪ محضر في وسائط التعرض. قم بإغلاق الألواح بورق بارافيلم أو رقائق مانعة للتسرب لاصقة لمنع تبخر وسط الاستزراع واحتضان الألواح عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
بعد 24 ساعة من التعرض الكيميائي للاختبار ، تخلص بعناية من وسائط التعرض من الآبار عن طريق صب المحتوى في صينية تجميع وغسل كل بئر ب 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. ثم لإزالة PBS دون فقد الخلايا ، اسكبه بعناية في صينية تجميع. لإجراء فحوصات Alamar Blue أو AB و CFDA-AM ، أضف 100 ميكرولتر من المحلول المعني لكل بئر واحتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 28 درجة مئوية.
بعد ذلك ، قم بقياس التألق في قارئ لوحة مضان عند الأطوال الموجية المناسبة للإثارة والانبعاث المذكورة في النص. لإجراء الفحص الأحمر المحايد أو NR ، خذ محلول العمل NR بتركيز 40 ميكروغرام لكل مليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 600 جرام لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة حلول AB و CFDA-AM المضافة مسبقا بعناية من الآبار عن طريق صب المحتوى في صينية التجميع.
باستخدام ماصة دقيقة متعددة القنوات ، أضف 100 ميكرولتر من محلول العمل NR لكل بئر واحتضان اللوحة عند 28 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بمجرد انتهاء الحضانة ، اسكب محلول NR بعناية من اللوحة في صينية تجميع ، واغسل الآبار بإضافة 150 ميكرولترا من PBS لكل بئر. بعد الغسيل ، أضف 150 ميكرولترا من محلول استخراج NR لكل بئر واحتضن اللوحة عن طريق هزها برفق على شاكر لوحة لمدة 10 دقائق قبل قياس الامتصاص عند 540 نانومتر باستخدام قارئ الألواح.
لإجراء اختبار MTT ، بعد التعرض الكيميائي للاختبار على مدار 24 ساعة ، قم بإزالة وسائط التعرض بعناية عن طريق صب المحتوى في صينية تجميع واستخدام ماصة دقيقة متعددة القنوات ، أضف 100 ميكرولتر من محلول عمل MTT لكل بئر في الظلام. احتضان اللوحة عند 28 درجة مئوية لمدة أربع ساعات في الظلام. ثم تخلص من محلول MTT عن طريق صب المحتوى في صينية تجميع وإضافة 100 ميكرولتر من DMSO في كل بئر لاستخراج بلورات الفورمازان.
احتضن اللوحة على شاكر لوحة لمدة 10 دقائق قبل قياس الامتصاص عند 517 نانومتر باستخدام قارئ اللوحة. بالنسبة لفحص AP ، أظهرت الآبار المقابلة للتركيزات الفارغة والتحكم الإيجابي والسامة للخلايا العالية للمواد الكيميائية الاختبارية اللون الأزرق ومضان منخفض يشير إما إلى غياب أو انخفاض الخلايا القابلة للحياة. في المقابل ، فإن الآبار المقابلة لتركيزات منخفضة سامة للخلايا من اختبار كيميائي والتحكم السلبي الذي يحتوي على عدد كبير من الخلايا القابلة للحياة حولت الريزازورين إلى ريسوروفين وردي له مضان أعلى.
بالنسبة لمقايسة NR ، تكون التركيزات عالية السمية للخلايا للمواد الكيميائية للاختبار والتحكم الإيجابي شفافة أو وردية شاحبة مع امتصاص منخفض ، في حين أن الآبار التي تحتوي على خلايا قابلة للحياة تحتفظ بصبغة NR تعرض اللون الوردي الداكن والامتصاص العالي. وبالمثل ، بالنسبة لمقايسة MTT ، تكون الآبار التي لا تحتوي على خلايا قابلة للحياة شفافة ، في حين أن تلك التي تحتوي على خلايا قابلة للحياة تحول MTT إلى فورمازان بنفسجي اللون. بناء على النسب المئوية المحسوبة لصلاحية الخلية ، تم تقدير نصف تركيز المثبط الأقصى أو قيمة IC50 للمواد الكيميائية الاختبارية المختلفة في خطوط خلايا ZFL و ZEM2S.
لم يلاحظ أي اختلاف كبير في صلاحية الخلية للمزارع مع وبدون FBS ، مما يشير إلى ملاءمة وسائط الاستزراع المحرومة من FBS لفترة التعرض الكيميائي البالغة 24 ساعة. لم تظهر مقايسات MTT و NR أي تأثير كبير لتركيزات DMSO المتغيرة من 0.1٪ إلى 1٪ على صلاحية الخلية ، مما يشير إلى أن خطوط الخلايا هذه تدعم استخدام DMSO كمذيب يصل إلى 1٪ إيلاء اهتمام خاص أثناء التعامل مع الخلايا المطلية لتجنب الانفصال الذاتي أثناء الإجراء بأكمله وإعداد محلول العمل الأحمر المحايد بعناية لتجنب أي ترسيب صبغة. يمكن تطبيق هذا الإجراء على الدراسات التي تتناول العديد من جوانب التأثيرات الكيميائية على الأسماك باستخدام النماذج المختبرية ، والمساهمة في تقدم أي دراسات سمية بيئية حيوانية.
