وقد تم توفير التمويل من خلال المنح NIH 5T32CA09216 - 26 (لJSB) ​​، وK01 AR055619 - 01A1 و 3 K01 AR055619 - 03S1 (لDML) ، وكذلك من قبل مؤسسة عصير الليمون حامل اليكس ، والخلايا الجذعية معهد هارفارد والسرطان الأمريكية المجتمع.

1. microinjection الحمض النووي للأجنة الزرد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصبح خطي rag2 : لهضم كل 10μg البلازميد مع NOTI عند 37 درجة مئوية خلال الليل يبني GFP الحمض النووي (11) : cMyc وrag2 : :. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفينول : استخراج الكلوروفورم ويعجل البلازميدات وresuspend في كل من 2 20μL O. H </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز الحمض النووي عن طريق تشغيل تخفيف 1:1 ، 1:05 و 1:10 من هضم كل البلازميد على agarose هلام 1 ٪ مع 10μL ، و20μL 5μL من سلم ال DNA عالية المدى. هذا النوع من القياس الكمي عموما أكثر دقة من قراءة مطياف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يخفف من تركيز الحمض النووي للنهائي في 60ng/μL 1M بوكل TE X +0.5 للحقن في سلالة - CG1 (أو سلالة مسانج أخرى) باستخدام الأجنة الزرد 30ng/μL rag2 : cMyc + 30ng/μL rag2 : GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي إجراء الحقن كما أثبتت في السابق 12 ، 13. باختصار ، يتم تعيين الزرد الذكور والإناث حتى في غرف التزاوج الليلة قبل الحقن. في يوم من الحقن ، ويتم تحميل الحمض النووي في إبرة الحقن ، ويتم ضبط الضغط بحيث يتم طرد فقاعة بقطر 50μm (30pg DNA) ، والتي تقاس بواسطة ميكرون المرحلة. ثم يتم حقن الأجنة في مرحلة واحدة الخلية ، مع الحمض النووي يتم حقنه مباشرة في الخلية ، وليس في صفار البيض. البقاء للأجنة ويرقات CG1 حقن عادة ما يكون ضعيفا ، و 5 ٪ فقط من الأسماك ستضم بنجاح التحوير ، وبالتالي ، ينبغي حقن&gt; 600 الأجنة للتأكد من أن بعض الأسماك وتطوير اللوكيميا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الأجنة المحقونة في 28.5 درجة مئوية ، وإزالة أجنة ميتة بعد 24hr. ثم يتم نقل الحيوانات إلى خزانات كبيرة في 5 أيام من الحياة ورفعت 14 كما هو موضح سابقا. </li></ol> 2. الكشف عن T - ALL الابتدائية في يرقات الزرد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما يقرب من 28 يوما بعد الحقن ، وتخدير اليرقات الزرد بإضافة 200μL من 4ng / م Tricane - S 25mL لنظام المياه الأسماك في طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دراسة اليرقات من أجل التنمية المسمى - T - ALL fluorescently باستخدام المجهر epifluorescence في 20X التكبير ، وذلك باستخدام طول موجي الإثارة وانبعاث 485/20 530/25 تصفية للكشف عن GFP مضان (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل اليرقات الورم إيجابية من تلك التي هي سلبية. يمكن فحص اليرقات عند نقطة سلبية وقت لاحق ، مرة واحدة قد نمت بشكل اكبر الاورام ، لضمان عدم إهمال أي تي جميع الأسماك إيجابية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد T - ALL الأسماك إيجابية على الأقل مرة واحدة في الأسبوع باستخدام المجهر epifluorescence لتتبع نمو الورم. </li></ol> 3. عزل وتنقية fluorescently المسمى خلايا اللوكيميا الابتدائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما خلايا اللوكيميا GFP إيجابية تجاوزت&gt; 50 ٪ من الحيوانات ، والأسماك التضحية بإضافة 1mL من 4ng/mL Tricane - S في طبق بتري تحتوي على نظام المياه 9mL الأسماك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع السمك في طبق بتري جديدة تحتوي على 1mL 0.9X برنامج تلفزيوني مع 5 ٪ مصل بقري جنيني للتخفيف من الخلايا. نقع السمك مع الماصة الحلاقة ، شفرة الخليط إلى فصل كتل زنزانة كبيرة ، ثم تمرير الخلايا من خلال مصفاة شبكة 40μm في أنبوب 50mL. ليس من الضروري أن ننأى عن كتل داخل خلايا الأنسجة واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500μL الماصة للخلايا لأنبوب 4mL البوليسترين. إضافة 1μL يوديد propidium 1mg/mL (PI) ، والتي سوف تسمية الخلايا الميتة. الدوامة ، ثم إبقاء الخلايا على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضحية من النوع البري CG1 الأسماك ، وأضعف في سلالة بنفس الطريقة المذكورة أعلاه لجمع الخلايا الطبيعية ، والتي تكون بمثابة الناقل للخلايا الورم خلال FBS 4mL 5 ٪ transplant.Add في برنامج تلفزيوني 0.9X إلى أنبوب 50mL لما مجموعه حجم 5mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا الطبيعية ، وإلى تمييع 3x10 5 خلايا / مل في FBS 5 ٪ في برنامج تلفزيوني 0.9X ، ثم 100μL/well الماصة لوحة 96 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإسفار باستخدام فارز الخلايا المنشطة (FACS) ، فرز GFP ، PI إيجابية الخلايا السرطانية السلبية (الشكل 2A ، B) في لوحة 96 - جيدا تحتوي على خلايا الدم في الجرعات التالية : 10 خلية / إضافة إلى 48 بئرا ، و 100 خلية / جيد في 24 بئرا ، 1000 خلية / إضافة إلى 12 بئرا ، وخلايا 10000 / إضافة إلى 6 آبار. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي أن يتم فرز الخلايا في 10000 بئر بدون خلايا الدم العادية ، وreanalyzed باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لتقييم الجدوى والنقاء من الخلايا مرتبة (الشكل 2C). </li></ol> 4. الحد من عمليات الزرع في التخفيف الزرد الكبار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لوحة 96 - جيدا في 2000xg لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 95μL من طاف وresuspend الخلايا في 5μL المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد الكبار (&gt; 60 يوما) مسانج الجانب البطني حتى الزرد ، وحقن تعليق خلية في التجويف البريتوني ، وذلك باستخدام 26G / 2 &quot;حقنة صغيرة. الزرد لا بد من تخدير قبل الزرع. يتم زرعها عادة ، يتم زراعة 45 السمك مع خلايا اللوكيميا 10 ، وزرع 20 مع 100 خلية ، يتم زرع خلايا 7 مع 1000 والسمك 5 مع الخلايا T - ALL 10000. </li></ol> 5. تحليل لتحديد سرطان الدم ، بدء تواتر الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما يقرب من 28 يوما بعد الزرع ، ودراسة مع الأسماك المزروعة باستخدام مجهر epifluoresence طول موجة الإثارة وانبعاث 485/20 530/25 تصفية للكشف عن GFP مضان. تسجيل عدد من الأسماك ايجابية في عدد من الأسماك حقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة النظر في الأسماك كل 14 يوما لمدة تصل إلى 90 يوما ، وتسجيل عدد من الأسماك إيجابية. عندما سمكة الورم إيجابية تصبح المحتضرة ، التضحية الحيوانية Tricane - S جرعة زائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال النتائج في الجدول ، كما هو مبين في الشكل 3D. تحميل البيانات في ELDA على شبكة الإنترنت (المتطرفة تحليل التخفيف الحد) في البرامج الإحصائية <a href="http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html">http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html</a> 15 ، والذي يستخدم تكرار الورم الحيوانات الايجابية والسلبية في كل جرعة زرع لتحديد تواتر الذاتي تجديد خلايا اللوكيميا داخل ALL - T الأساسي. </li></ol> 6. ممثل النتائج : microinjection الحمض النووي في الأجنة من الأسماك مسانج غالبا ما يؤدي إلى انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة من أجنة المحقون مع &lt;60 ٪ من الأجنة على قيد الحياة لمدة 24 ساعة. بالإضافة إلى ذلك ، بقاء الأسماك مسانج حقن عموما فقراء خلال نمو اليرقات ، مع كثير من الأحيان &lt;20 ٪ الباقين على قيد الحياة لمدة 28 يوما. ولذلك فمن المهم لحقن عدد كبير من الأجنة من أجل خلق الأسماك المعدلة وراثيا التي من شأنها تطوير T - ALL. كمثال على ذلك ، تم حقن الاجنة سلالة CG1 مع rag2 : cMyc + rag2 : GFP. والجينات المحورة في الجنين النامية شارك فصل ، بحيث أن كل خلية عن GFP وأعرب أيضا عن cMyc. كما تم عرض ليرقات الأولية T - ALL بعد 28 يوما (الشكل 1). وقد أظهرت الأعمال السابقة أن حوالي 5 ٪ من الأسماك حقن سيكون GFP إيجابية لخلايا تي داخل هذه الغدة الصعترية (الشكل 1) ، و 100 ٪ من هذه الأسماك وتطوير سرطان الدم حيث تصبح الخلايا T - 11 المحولة. في حين أن نسبة ضئيلة من الزرد سرطان الدم قد يكون أكثر تقدما من السهل جدا للكشف في اليوم 28 ، ومعظم سوف يكون لها سوى GFP إيجابية الغدة الصعترية (الشكل 1) ، يجب أن تدرس على حدة بحيث اليرقات تحت التكبير عالية لضمان أن تكون جميع إيجابية ويتم اختيار الأسماك. GFP - T - ALL إيجابية الخلايا ستتفوق&gt; 50 ٪ من الحيوانات ما بين 45-70 يوما. في المثال المقدمة ، وتمت التضحية الزرد في 65 يوما من الحياة ، وكانت معزولة خلايا اللوكيميا وFACS فرزها للحد من زراعة التخفيف. تم فرز الخلايا التي كانت واحدة يوديد propidium السلبية والإيجابية GFP (الشكل 2) في لوحة 96 - جيدا. وقد تم إعادة تحليل الخلايا على 10000 فرزها بغية تقييم جدوى (مثالي&gt; 95 ٪) والنقاء (مثالي&gt; 92 ٪ ، الشكل 2). زرع T - ALLS تنشأ عموما قبل 28 يوما ، ولكن بعض الأورام قد يستغرق أكثر من 60 يوما لتطوير. في هذا المثال ، في اليوم 28 ، شوهد الأورام مرحلة مبكرة كمجال للGFP إيجابية الخلايا بالقرب من موقع الحقن (الشكل 3B) ، في حين أن بعض ALLS تي كانت أكثر تقدما ، بعد أن توسعت لملء التجويف البريتوني (الشكل 3C) . وتظهر البيانات من الحد المقايسات التخفيف من زرع الخلايا الأولية الثلاثة مختلفة T - 3D ALLS في الشكل. لهذه التجارب ، وقد تم زرع أكثر من 220 حيوان ، والتي يمكن إنجازها بسهولة من قبل شخص واحد في غضون عدة ساعات. وأظهر تحليل البيانات باستخدام البرمجيات التي ELDA ، في المتوسط ​​، 1 في 135 T - ALL الزنزانات الذاتي تجديد خلايا اللوكيميا ، نشر (الشكل 3E). <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> كما تم عرض للنمو سرطان الدم الأولية 28 يوما بعد الحقن الشكل 1 يرقات اسماك الزرد حقنه في مرحلة واحدة مع خلية خرقة : : : - cMyc + خرقة - eGFP :. وكان السمك (*) GFP إيجابية خلايا تي في الغدة الصعترية ، وهذا السمك ستطور T - ALL باسم خلايا تي أصبحت تتحول مع مرور الوقت. هذه المرحلة هو أمر شائع جدا في اليوم 28. وكان احد الأسماك (**) متقدمة T - ALL الذي انتشر في الأنسجة اللينة. المتبقيين الأسماك هي سلبية للنمو الورم. لقد التقطت الصورة في التكبير 16X. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. Fluorescently المسمى T - ALL تم فرز الخلايا من الحيوانات المريضة واستخدمت في تخفيف مقايسة الحد زرع الخلايا. أولا ، وضعت بوابة واحدة لتحديد الخلايا (اللوحة اليسرى العليا) ، ثم يتم اختيار خلايا يوديد propidium السلبية (اللوحة اليسرى وسط). أخيرا ، وضعت بوابة لتحديد فقط GFP إيجابية للفرز خلايا اللوكيميا (اللوحة اليسرى السفلى). وينبغي أن يكون فرز الخلايا reanalyzed لتقييم سلامة ونقاء قبل الزرع (لوحات اليمين). <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. فحصت اسماك الزرد لنمو سرطان الدم 28 يوما بعد الزرع. الأسماك هي الورم إما NEGاطر النسبية (A) ، وورم صغير المتزايدة في موقع الحقن (B) ، أو لديك سرطان الدم تقدما (C). والتقطت هذه الصور في التكبير 7X. يتم تسجيل عدد من سرطان الدم إيجابية الأسماك في عدد من الأسماك المزروعة في كل التخفيف ، كما في (D). يتم إدخال البيانات في برنامج ELDA على شبكة الإنترنت لحساب عدد الذاتي تجديد خلايا اللوكيميا والعلوية والسفلية فترات الثقة 95 ٪ (E).

<ol>
	<li>Zhou, B. -. B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-initiating+cells:+challenges+and+opportunities+for+anticancer+drug+discovery.">Tumour-initiating cells: challenges and opportunities for anticancer drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 8, 806-823 (2009).</li><li>Dick, J. E., Bhatia, M., Gan, O., Kapp, U., Wang, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+human+stem+cells+by+repopulation+of+NOD/SCID+mice.">Assay of human stem cells by repopulation of NOD/SCID mice.</a> Stem Cells. 15, 199-207 (1997).</li><li>Bonnefoixa, T., Bonnefoixa, P., Verdiela, P., Sotto, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+limiting+dilution+experiments+with+generalized+linear+models+results+in+a+test+of+the+single-hit+Poisson+assumption.">Fitting limiting dilution experiments with generalized linear models results in a test of the single-hit Poisson assumption.</a> J Immunol Methods. 194, 113-119 (1996).</li><li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+of+the+day:+zebrafish+as+a+human+cancer+model.">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).</li><li>Taylor, A. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Tumor+Assays:+The+State+of+Transplantation.">Zebrafish Tumor Assays: The State of Transplantation.</a> Zebrafish. 6, 339-346 (2009).</li><li>Mizgirev, I., Revskoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+clonal+zebrafish+lines+and+transplantable+hepatic+tumors.">Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors.</a> Nat Protocols. 5, 383-394 (2010).</li><li>Mizgirev, I. V., Revskoy, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantable+Tumor+Lines+Generated+in+Clonal+Zebrafish.">Transplantable Tumor Lines Generated in Clonal Zebrafish.</a> Cancer Research. 66, 3120-3125 (2006).</li><li>Smith, A. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115, 3296-3303 (2010).</li><li>Kelly, P. N., Dakic, A., Adams, J. M., Nutt, S. L., Strasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Growth+Need+Not+Be+Driven+by+Rare+Cancer+Stem+Cells.">Tumor Growth Need Not Be Driven by Rare Cancer Stem Cells.</a> Science. 317, 337-337 (2007).</li><li>Rosen, J. M., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Increasing+Complexity+of+the+Cancer+Stem+Cell+Paradigm.">The Increasing Complexity of the Cancer Stem Cell Paradigm.</a> Science. 324, 1670-1673 (2009).</li><li>Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+T+cell+development,+ablation,+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish.">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7369-7374 (2004).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELDA:+Extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays.">ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> Journal of Immunological Methods. 347, 70-78 (2009).</li><li>Ignatius, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+identifies+that+myf5++embryonal+rhabdomyosarcoma-propagating+cells+are+dynamically+reorganized+during+tumor+growth.">In vivo imaging identifies that myf5+ embryonal rhabdomyosarcoma-propagating cells are dynamically reorganized during tumor growth.</a> , (2010).</li><li>Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27, 4242-4248 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ان نقطة القوة الرئيسية لاستخدام الزرد في أبحاث السرطان والتي يمكن استخدامها أعداد كبيرة من الحيوانات وبتكلفة منخفضة نسبيا. وهذا أمر مهم لا سيما في مجال الحد المقايسات تخفيف زرع الخلايا ، التي تستخدم فيها نسب من الحيوانات التي تطور الأورام المزروعة إلى العدد الإجمالي لتحديد زرع ورم بدء تواتر الخلية. في أسلوب المعروضة هنا ، وتستخدم أكثر من 70 عملية زرع الحيوانات المتلقي في مقايسة ، وتقديم تقدير دقيق لعدد خلايا الورم نشر. وينبغي أن يكون الأمثل كلا من عدد الحيوانات المستخدمة وجرعة من الخلايا السرطانية المزروعة لنموذج معين السرطان ، على سبيل المثال ، إذا تبين التجارب الأولية للورم الخلايا بدء نادرة ، قد تكون مفيدة زرع جرعات 100000 ، 50000 ، 10000 و 1000 في الخلايا زرع. مسانج سلالات الزرد مفيدة في الحد من تحليل التخفيف. ومع ذلك ، لم يتم حتى الآن هذه السلالات التي يشيع استخدامها في جميع المختبرات ، وبعض النماذج من سرطان الزرد وجود لها إلا في الأسماك خيفي. يمكن إجراء عمليات زرع الخلايا الحد التخفيف في البرية من نوع السلالات التي خضعت الاجتثاث المناعي ، وإن كان من المحتمل أن يحسب تردد خلية الذاتي وتجديد 1-10 أضعاف أعلى مما لو استخدمت مسانج الزرد 8. ومن المهم أن نلاحظ أنه ينبغي استخدام جرعات أكبر من الخلايا للزرع في غير مأمن المتلقين ، مطابقة للإشعاع ، وبعض الخلايا السرطانية لن يكتب له البقاء في زرع المكروية الأجنبية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من الأورام تبدأ في التراجع بعد 21 يوما عند الحيوان المتلقي النظام المناعي للشفاء ، لذا يجب أن يتم تقييم الحيوانات لنمو الورم في كل 7 أيام بعد الزرع. الأساليب المقدمة هنا هي مناسبة للاستخدام مع أي نموذج سرطان الزرد ، وحتى الآن استخدمت لتحديد الورم بدء تردد في كل خلية تي خلية سرطان الدم الليمفاوي الحاد 8 ، ونموذجا الأورام الصلبة ، العضلية المخططة 16. وfluorescently المسمى هذه الأورام عن طريق الحقن المشترك للأجنة مع الجين الورمي على حد سواء ، وعلامة فلوري ، لأن الحمض النووي المشترك تفصل ، أي خلية التعبير عن الجين الورمي وأعرب أيضا عن بروتين فلوري 17. بينما يوصى مضان لأن يسهل تتبع نمو الورم دون الحاجة إلى التضحية الحيوانية ويوفر طريقة مباشرة إلى الأمام لعزل الخلايا السرطانية عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية ، فإنه من الممكن تسمية الخلايا السرطانية مع الأجسام المضادة للورم محددة لتسهيل صناع تنقية بهم ، على الرغم من الأجسام المضادة قد تلطيخ في الزرد تتطلب التحسين. أخيرا ، مرة واحدة وقد تم تحديد حدوث ورم نشر خلايا الورم لنوع معين ، فمن الممكن استخدام هذه المقايسات لتحديد الآليات التي تحكم وتيرتها الخلية. على سبيل المثال ، يمكن علاج الخلايا السرطانية الأولية مع مثبطات محددة قبل تحديد مسار التخفيف زرع ، أو السمك يمكن زرعها مداوي أنفسهم مع المخدرات. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم التلاعب في الصفات الوراثية للأورام أنفسهم عن طريق حقن الأسماك مرحلة واحدة مع الخلية الجينات في المصالح ، بحيث يؤدي الأورام الابتدائية والافراط في التعبير عن الجينات. في هذه التجارب ، سوف يلاحظ أي تأثير على تجديد الذات وتيرة خلية في المقايسات تخفيف محدود.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم الكاشف </th><th> شركة </th><th> رقم كتالوج </th></tr><tr><td> NOTI تقييد انزيم </td><td> نيو إنجلاند Biolabs </td><td> R0189 </td></tr><tr><td> الفينول : الكلوروفورم </td><td> EMD الكيميائية الحيوية </td><td> 6805 - OP </td></tr><tr><td> 5M بوكل </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> تريس 100X - EDTA </td><td> سيغما الدريخ </td><td> T9285 </td></tr><tr><td> ارتفاع متوسط ​​سلم DNA </td><td> Fermentas </td><td> R0621 </td></tr><tr><td> مسانج الزرد </td><td></td><td> مراجع 6-8 </td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> Gibco </td><td> 16000-036 </td></tr><tr><td> Propidium التأيد </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P4864 </td></tr><tr><td> 26G / 2 &quot;Microsyringe </td><td> هاميلتون </td><td> 80366 </td></tr><tr><td> 40μm مصفاة شبكة خلية </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish

الخلايا السرطانية الذاتي تجديد هي أنواع الخلايا السرطانية فقط في غضون التي لديها قدرة غير محدودة لتشجيع نمو الورم ، وبالتالي فهي معروفة للورم خلايا التكاثر ، أو خلايا الورم البدء. ويعتقد أن استهداف هذه الخلايا ذاتية تجديد لتدمير ستمنع تطور الورم ومنع الانتكاس ، وتحسين تشخيص المريض كثيرا 1. الطريقة الأكثر شيوعا لتحديد وتيرة الذاتي تجديد خلايا الورم داخل خلية تخفيف الحد مقايسة لزراعة الأعضاء ، حيث يتم زرع الخلايا السرطانية في الحيوانات المتلقي بجرعات متزايدة ، وتستخدم نسبة من الحيوانات التي تطور الأورام وحساب عدد في تقرير المصير ، تجديد الخلايا السرطانية داخل العينة الأصلي 2 ، 3. من الناحية المثالية ، سوف تستخدم عددا كبيرا من الحيوانات في كل تجربة تخفيف تحد لتحديد بدقة وتيرة نشر خلايا الورم. ومع ذلك ، وتجارب واسعة النطاق تشمل الفئران هي مكلفة ، ومعظم المقايسات تخفيف الحد من استخدام الفئران فقط 10-15 في التجربة. وقد اكتسبت شهرة الزرد كنموذج السرطان ، في جزء كبير نظرا لسهولة التلاعب بها الوراثية والاقتصاد التي يمكن أن يؤديها تجارب واسعة النطاق. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على أكثر أنواع السرطان على غرار لتقليد في الزرد عن كثب على نظيره 4 الأمراض التي تصيب البشر. في حين أنه من الممكن زراعة خلايا الورم من الأسماك إلى آخر عن طريق شبه قاتلة تشعيع الحيوانات المتلقية ، وتجديد النظام المناعي بعد 21 يوما وغالبا ما يسبب انحسار الورم 5. وقد سهلت إنشاء مؤخرا الزرد مسانج الدراسات زرع ورم كبير 6-8. يمكن رصدها لهذه الحيوانات ، زرع خلايا متطابقة جينيا تدبر الورم بقوة في الأسماك المستفيدة ، ونمو الورم على مدى فترات طويلة من الزمن. مسانج الزرد مثالية للحد من المقايسات زرع التخفيف في أن الخلايا السرطانية لم يكن لديك على التكيف مع النمو في المكروية الأجنبية ، الأمر الذي قد يقلل الذاتي تجديد الخلايا تردد 9 و 10. بالإضافة إلى ذلك ، واحدة وقد تم زرع الخلايا بنجاح باستخدام الزرد مسانج (8) وعدة مئات من الحيوانات ويمكن بسهولة واقتصاديا زرع في وقت واحد ، وكلاهما يعمل على تقديم تقديرات أكثر دقة للتجديد الذاتي تردد الخلية. هنا ، يقدم وسيلة لخلق الابتدائية ، T - الخلية fluorescently الحادة التي تحمل علامات سرطان الدم الليمفاوي (T - ALL) في مسانج الزرد ، وزرع هذه الأورام في الحد من التخفيف في الأسماك البالغة لتحديد الذاتي تجديد تردد الخلية. بينما يرد اللوكيميا كمثال ، فإن هذا البروتوكول هو مناسبة لتحديد وتيرة نشر ورم الخلايا باستخدام أي نموذج السرطان في الزرد.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish at JoVE.com

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

وتستخدم الحد المقايسات زرع الخلايا لتحديد تخفيف وتيرة نشر خلايا الورم. يصف هذا البروتوكول وسيلة لتوليد الزرد مسانج أن fluorescently بسرطان الدم المسمى وتفاصيل كيفية عزل وزرع هذه الخلايا في الحد من سرطان الدم التخفيف في التجويف البريتوني من الزرد الكبار.

قياس التردد من ورم الخلايا باستخدام الحد من نشر زرع الخلايا في التخفيف اسماك الزرد مسانج

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

quantifying-frequency-tumor-propagating-cells-using-limiting-dilution

Research

JoVE Journal

Biology

19.1K Views.  Harvard Medical School. وتستخدم الحد المقايسات زرع الخلايا لتحديد تخفيف وتيرة نشر خلايا الورم. يصف هذا البروتوكول وسيلة لتوليد الزرد مسانج أن fluorescently بسرطان الدم المسمى وتفاصيل كيفية عزل وزرع هذه الخلايا في الحد من سرطان الدم التخفيف في التجويف البريتوني من الزرد الكبار.

Video: Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

زرع نخاع الكلى في الجامعة اسماك الزرد الكبار

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell therapy may alleviate many of the symptoms associated with lung disease and induce alveolar repair in adults. Concurrent with the ongoing search for stem cells applicable for human treatment, precise delivery and homing (to the site of disease) must be reassured for successful therapy. Here, I report that stem cells can safely be instilled via the trachea opening a non-stop route to the lung. This method involves a skin incision, caudal insertion of a cannula into and along the tracheal lumen, and injection of a stem cell vehicle mixture into airways of the lung. A broad range of media solutions and stabilizers can be instilled via tracheotomy, resulting in the ability to deliver a wider range of cell types. With alveolar epithelium confining these cells to the lumen, lung expansion and negative pressure during inhalation may also assist in stem cell integration. Tracheal delivery of stem cells, with a quick uptake and the ability to handle a large range of treatments, could accelerate the development of cell-based therapies, opening new avenues for treatment of lung disease.

Significant breakthroughs in stem cell identification are continuously being made. To translate these discoveries, however, novel methods for cellular delivery must be devised. Here I report that the airways provide a safe route for stem cell transplantation to the lungs.

القصبة الهوائية : وهناك طريقة لزرع الخلايا الجذعية في الرئة

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

زرع عدسة في اسماك الزرد وتطبيقاتها في تحليل المسوخ العين

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

جيل من الخلايا البشرية باء تنشيط CD40

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

الأنسجة الجنينية الوهم المستهدفة : اسماك الزرد المعيدة زرع الخلايا

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

زرع الخلايا مباشرة في الكلى من اسماك الزرد الكبار

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

في Electroporation المجراة من Morpholinos في الكبار التجديد زعنفة الذيل الزرد

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

تحليل الجمجمة التشكل في الزرد عن طريق 4D متحد البؤر المجهري

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

المعدلة وراثيا القوارض الفحص لقياس ذكر جرثومة خلية متحولة التردد

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...