الهدف العام لهذا الإجراء، وأوضح استخدام سيسبلاتين كعامل nephrotoxic في الأسماك حمار وحشي الكبار، وتحليل الالتهاب، وموت الخلايا في أنسجة الكلى. لتحقيق هذا وسمك حمار وحشي الكبار هو تخدير ووزنها لحقن في جرعة محددة من سيسبلاتين في تجويف الصفاق. بعد رصد الوفيات، يتم تشريح الكلى ويتم عزل الخلايا لقياس التدفق الخلوي أو ثابتة وتشريح ليتم تحليلها عن طريق فحص TUNEL الفلورسنت.
الإجراءات التالية يمكن أن تساعد على الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الكلى باستخدام الآثار الكلوية من سيسبلاتين كأداة لتطوير نموذج إصابة الكلى الحادة والأسماك حمار وحشي الكبار. ويمكن استخدام هذا النموذج لاستكشاف أهداف علاجية جديدة في الحماية الكلوية، وكذلك توضيح آلية التجديد في الكلى الأسماك حمار وحشي. سيسبلاتين هو عامل العلاج الكيميائي المستخدمة لعلاج مجموعة متنوعة من السرطان.
ومع ذلك، يمكن أن تتراكم بسهولة في الكلى، وتوليد موت الخلايا، والتهاب، وانخفاض وظائف الكلى. تأثير سيسبلاتين تعتمد على الجرعة, حتى تتمكن من خفض زيادة الجرعات لدينا تعتمد على أهدافك. التقنيات المستخدمة هنا لتحليل الالتهاب وموت الخلايا ليست حصرا لنشر نموذج المرض.
يمكن أن يساعد قياس التدفق الخلوي في أسماك الحمار الوحشي في توضيح الحالات الالتهابية للحيوان بطريقة كمية ، بينما في TUNEL نقول أنه يمكن توضيح وجود الخلايا المنبثقة في السياقات الفسيولوجية والمرضية. قبل البدء في التجربة، قم بإعداد محلول عمل سيسبلاتين عن طريق تخفيف محلول المخزون إلى 820 ميكروغرام لكل ميل في كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪. بعد ذلك ، تخدير سمك حمار وحشي آخر وتجفيف فائض الماء على بعض المناشف الورقية.
وزن الأسماك عن طريق وضعها على مقياس، مع الأخذ في الاعتبار الوزن. إجراء العمليات الحسابية لمعرفة حجم الدقيق لحقن. لتحقيق جرعة 120 ميكروغرام لكل غرام من الوزن، استخدم الصيغة التالية.
تقسيم الجرعة النهائية بجرعة من محلول العمل وتحويل هذا العدد إلى ميكرولتر، عن طريق ضرب ل1000 للحصول على حجم 120 ميكروغرام من سيسبلاتين. ثم، ضرب هذا العدد من وزن السمك للحصول على الحجم النهائي لحقنها. ضع سمكة على اسفنجة مبللة، مع كوب صغير لعقد عليه.
مع الجانب البطني لأعلى وملء حقنة الأنسولين مع حجم محسوب من سيسبلاتين. أدخل الإبرة على خط الوسط البطني في زاوية ضحلة، وسحب بلطف الجدار البطني لتجنب ثقب الأعضاء الداخلية. ثم حقن الحل.
بعد الحقن، ضع سمكة في خزان للتعافي من التخدير، وانتظر علامات التعافي مثل السباحة والحركات المناسبة. رصد لتلك الأسماك مرتين في اليوم للأيام المقبلة. في هذه الجرعة، سيسبلاتين تحفز حوالي 30٪ من الوفيات في أول 24 ساعة.
قتل الأسماك وتجفيف فائض من الماء في منشفة ورقية. بعد إزالة الرأس والأعضاء الداخلية، استخدم إبر التشريح لتثبيت جدران الجسم. حدد موقع الكلى في الجدار الظهري للأسماك ، واستخدم ملقط لفصل الكلى.
وضع الكلى في لوحة بئر ستة مع حل بارد من برنامج تلفزيوني واحد 1X، 2٪ FBS والحفاظ على الجليد. بعد ذلك ، التقط الأنسجة مع بعض السائل ومررها عبر مصفاة خلايا 40 ميكرون ، وتهز الأنسجة بلطف باستخدام المكبس المحقن. غسل مرتين مع برنامج تلفزيوني واحد 1X، 2٪FBS.
وجمع الخلايا في أنبوب الصقر 50 ميل. ثم الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 400 G.Careful بيك اب supernatant مع ماصة والتخلص منه. إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X الباردة لإعادة تعليق الخلايا ووضعها في أنبوب قياس الخلايا تدفق خمسة ميل.
أبقهم على الجليد خذ 10 ميكرولترات من العينة واخلطها مع 90 ميكرولتر من أزرق المثقب في أنبوب Eppendorf. إضافة 10 ميكرولتر من الخليط إلى غرفة نيوباور وعدد الخلايا في المجهر.
خذ الخلايا لقراءتها بواسطة مقياس الخلايا، ثم قم بتحليل النتائج التي تحدد مجموعة اهتماماتك. لهذا الإجراء، قتل الأسماك وإزالة الأعضاء الداخلية ترك الكلى تعلق على الجسم. ثم، دبوس جدران الجسم إلى سطح الفلين ووضعه تدريجيا على حل التثبيت.
أبقها أربع درجات بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تشريح الكلى مع ملقى غرامة. حاول ألا تعطله
وضعه في طبق بتري صغير أو أنبوب Eppendorf مع برنامج تلفزيوني 1X لشطف. تغيير برنامج تلفزيوني وإعداد 2٪ agarose لتوليد مصفوفة دعم للكلى قبل أن عملية بقوة. تجاهل جميع برنامج تلفزيوني المتبقية وصب agarose ببطء.
ثم ضع الكلى مع ملقط ناعم لمنعها من الطي. دع الآغروز يترسخ في درجة حرارة الغرفة. بعد التصلب agarose، استخدم مشرط لقطع أغاروز حول الكلى تشكيل مكعبات صغيرة.
ضع مكعبات الآغروز داخل كاسيت النسيج وأرسلها للمعالجة النسيجية لتضمين الأنسجة في البارافين. كتل البارافين، وسوف نقطع بعد ذلك في خمسة أقسام سمك ميكرون. إزالة الشمع الشرائح والاحتفاظ بها في الماء المقطر.
إعداد غرفة حاضنة الظلام، ووضع المناشف الورقية الرطبة في الجزء السفلي. وضع الشرائح في غرفة مظلمة، وإضافة Proteinase K لبيرمابيليز من الأنسجة. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
في حين يتم احتضان العينات، وإعداد خليط رد فعل TUNEL، عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من محلول الانزيم على 450 ميكرولتر من محلول التسمية. والحفاظ على حماية من الضوء. التقاط غرفة مظلمة وغسل شريحة مرتين مع واحد 1X برنامج تلفزيوني.
بعد ذلك، قم بتجفيف الشرائح وعلى خليط تفاعل TUNEL. و تحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين بعد الحضانة، اغسل هذه الشرائح مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني واحد 1X.
وإضافة DAPI لتلطيخ عداد النوى. الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، محمية من الضوء. شطف ثلاث مرات مع واحد 1X برنامج تلفزيوني.
وبعد ذلك، قالب الشرائح مع وسيلة مضادة للتلاشي المائية. ضع زلة غطاء. وختم مع طلاء الأظافر.
تصور العينات في المجهر الفلورسنت. في هذا الرسم البياني، من الممكن أن نرى أن سيسبلاتين له تأثير استجابة الجرعة على بقاء الأسماك، مقارنة مع السيطرة حقن فقط مع كلوريد الصوديوم 0.9٪. يمثل الخط الأحمر في هذا الرسم البياني جرعة من 120 ميكروغرام لكل غرام مستخدم في هذا الفيديو.
ويمكن تطبيق هذه الجرعة على الذكور والإناث, كما لم يتم العثور على فرق إحصائي بينهما. يسمح قياس التدفق الخلوي بتحديد الخلايا المختلفة الموجودة في الأنسجة. يتم تحديد مجموعات الخلايا الدموية في كلية العديد من الأسماك من حيث الحجم أو التشتت إلى الأمام والحبيبة أو الحجم المتناثر.
بهذه الطريقة ، من الممكن فصل المجموعات السكانية في خلايا الدم الحمراء ، والخلايا الليمفاوية ، والخلايا الحبيبية ، والسلائف الدموية. هنا، استراتيجية البوابة الحالية اختيار المحببات، المفردات والخلايا الإيجابية MPO تسمح للعثور على السكان من العدلات في الكلى تميزت التعبير الفلوري من myeloperoxidase. في هذه الحالة ، تسبب حقن سيسبلاتين في زيادة النسبة المئوية للنيوتروفيليا الموجودة في الكلى.
يسمح فحص TUNEL بالكشف عن الخلايا المبرمج في الأنسجة من خلال مراقبة انزلاق الأنسجة في الكلى بواسطة مجهر مضان ، فمن الممكن رؤية إشارة أبوتوبوتية داخل نواة بعض الخلايا ، هنا باللون الأحمر. يتناقض مع وصمة عار نووية في مثل هذا DAPI هنا باللون الأزرق. حقن سيسبلاتين زيادة وجود خلايا أبوتوبوتيك في الكلى، والتي يمكن تحديدها يدويا أو باستخدام برنامج صورة.
في نهاية هذا الفيديو يجب أن تكون قادرا على معرفة كيفية حقن وضبط جرعة سيسبلاتين للحث على إصابة الكلى الحادة في الأسماك حمار وحشي الكبار. وكيفية تشريح الكلى لأغراض مختلفة. قياس التدفق الخلوي هو أداة ممتازة من شأنها أن تساعدك على فهم الملف الشخصي لأنواع الخلايا المختلفة التي تعتمد على توافر خطوط tragenclave في المختبر الخاص بك.
تذكر أن تنظر في لون خطوط الناقلين إذا كنت ترغب في استخدام الأجسام المضادة لتسمية جميع أنواع الخلايا الخاصة بهم. إن اختبار TUNEL هو أداة بسيطة تسمح لنا بالكشف عن الخلايا والأنسجة المبرمج ، ويمكن تحليلها ليس فقط عن طريق المجهر ، ولكن أيضا عن طريق قياس التدفق الخلوي. تذكر، استخدم دائما معدات الحماية الشخصية أثناء الإجراء بأكمله.
