يوفر بروتوكول الرحلان الكهربائي الناجم عن الضوء أو LiDEP طريقة خطوة بخطوة لتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تقديم إجابات حول عدم تجانس عينات الخلايا الجذعية. تتمثل ميزة LiDEP في القدرة على إجراء تغييرات في الوقت الفعلي على تكوين القطب الافتراضي استجابة لعدم تجانس الخلايا الجذعية وهو أمر غير ممكن لطرق DEP التقليدية.
قد يواجه مستخدم جديد لهذه التقنية صعوبة في تكثيف ضوء جهاز العرض بدرجة كافية على جهاز الموائع الدقيقة لصنع القطب الافتراضي. ننصح بإعادة تكوين الإعداد حتى يعمل. سيساعد في إثبات الإجراء زوري رشاد ، طالب دراسات عليا من مختبري.
للبدء ، قم بإعداد القناة الدقيقة عن طريق ثقب ثقوب قطرها أربعة ملليمترات على شريط على الوجهين على بعد حوالي خمسة إلى ستة ملليمترات من حافة البعد الأقصر وتوسيطها بين الجوانب الأطول للشريط. باستخدام مشرط ، قم بقص خطين مستقيمين يفصل بينهما ثلاثة ملليمترات عبر الثقوب لضمان تشغيل الألواح الواقية على كلا وجهي الشريط أثناء قطع القنوات الدقيقة بالكامل. ضع علامة على الموقع بالكامل بعلامة قابلة للغسل لضمان محاذاة الثقوب المحفورة مع الثقوب المثقوبة في الشريط على الوجهين.
سيتم استخدام هذين الفتحتين كفتحات مدخل ومخرج لجهاز الموائع الدقيقة. احفر فتحتين بقطر ثلاثة ملليمترات في الشريحة الزجاجية العلوية ITO. بعد ذلك ، في الجزء العلوي من الزجاج المطلي ب ITO المحفور ، ضع الحافة الطويلة للشريط بمحاذاة الحافة الطويلة للزجاج.
قم بإزالة جانب واحد من الفيلم الواقي على الشريط على الوجهين. قم بمحاذاة فتحات الشريط في الشريحة الزجاجية العلوية ITO واضغط عليها معا برفق لإزالة الجيوب الهوائية ، خاصة بالقرب من القناة الدقيقة. قم بإزالة الفيلم الواقي الآخر من الشريط على الوجهين.
اضغط على الموليبدينوم والشريحة الزجاجية ITO المطلية بالسيليكون غير المتبلور المطابقة لحافة الشريحة الموصلة للصور المقابلة لجانب الخلوص المليمترين مع حافة الشريط على الوجهين باتجاه مركز الشريحة الزجاجية ITO العلوية. بهذه الطريقة ، توجد مخلفات بين ITO وشريحة ITO الموصلة للصور. اضغط على سطح مستو لضمان التصاق جيد وقطع الشريط الزائد على الجانبين.
لتوصيل مولد الوظائف ، قم بتطبيق شريط نحاسي على حواف طبقة زجاج ITO وطبقة زجاجية ITO مطلية بالصور. لف الشريط على جانب ITO أو مادة موصلة للصور من حافة الشريط على الوجهين إلى حوالي ثلاثة سنتيمترات على الجانب غير المطلي من الركيزة الزجاجية. لضمان نجاح تصنيع الجهاز ، استخدم مقياس الارتفاع لاختبار قراءة المقاومة بين الشرائح المطلية لكل من الركائز الزجاجية والشريط النحاسي الذي تم توصيله بالزجاج.
أضف 25 ملليلترا من الماء فائق النقاء إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا يحتوي على 4.25 جرام من السكروز و0.15 جرام من الجلوكوز. تخلط جيدا حتى يذوب نصف السكروز والجلوكوز ويعوض بالماء النقي حتى علامة 50 ملليلتر. ثم امزج هذا المخزن المؤقت DEP بقوة حتى يذوب تماما.
ضع 20 ملليلترا من محلول السكروز والجلوكوز المحضر في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. أضف 0.1 جرام من ألبومين مصل الأبقار ، BSA ، في الأنبوب. دوامة جيدا حتى يذوب كل BSA للحصول على تركيز نهائي من 0.5٪ BSA في المخزن المؤقت DEP.
ضع واحدا في 10 إلى الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية الستة أو HMSCs أو الكلى الجنينية البشرية ، HEK293 معلقة في ملليلتر واحد من وسط النمو في أنبوب طرد مركزي 10 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي ، خلايا HEK293 عند 201 G لمدة خمس دقائق و HMSCs عند 290 G لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي ، نضح الطاف.
01 وأعد تعليق الخلايا برفق في محلول عازل DEP واحد ملليلتر مع 0.5٪ BSA. كرر الطرد المركزي مرتين أخريين وأعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت DEP بنسبة 0.5٪ BSA. قم بإعداد عناصر الإعداد التجريبية مثل الكمبيوتر المحمول وجهاز العرض والعدسة الموضوعية والمجهر الرقمي ومولد الوظائف لتحديد الاستجابات الخلوية ل LiDEP.
ضع العدسة الموضوعية بمعدل 10 أضعاف وشريحة LiDEP والحامل أعلى عدسة جهاز العرض. استخدم الكمبيوتر المحمول لتصميم إسقاطات ضوئية مثل النجمة والماس وثلاثة خطوط وبيضاوية وقم بتوصيل الكمبيوتر المحمول بجهاز العرض. قم بتوصيل شريحة LiDEP بمولد الوظائف لتطبيق المجال الكهربائي للتيار المتردد.
لمراقبة الخلايا التي تعاني من قوة LiDEP ، استخدم مجهرا رقميا لتصوير تسجيل NVIDIA. بعد الانتهاء من الإعداد ، اغسل القناة الدقيقة بنسبة 70٪ من الإيثانول ثم كان التدفق 0.5٪ محلول BSA لإزالة الإيثانول في الخلايا السابقة. كرر التدفق ثلاث مرات لضمان الغسل الكامل لأن الخلايا المعرضة سابقا لحقل DEP ستستجيب بشكل مختلف عن الخلايا الجديدة وقد تعطل جمع البيانات.
قم بإزالة محلول 0.5٪ BSA باستخدام ماصة. بعد ذلك ، اضبط مولد الوظائف على الجهد والتردد المطلوبين. أضف بعناية 70 ميكرولترا من تعليق الخلية المحضر إلى القناة الدقيقة للجهاز باستخدام طرف ماصة أصغر ، وقم بإمالته قليلا في الفتحة باتجاه القناة الدقيقة لتجنب الانسكاب بسبب نحافة القناة الدقيقة.
امسح محلول الوصول باستخدام مناديل ورقية تستخدم مرة واحدة وتخلص منها في نفايات بيولوجية. بعد ذلك ، قم بإسقاط دوائر الهندسة الكهربائية الافتراضية المطلوبة أو الماس أو النجوم أو الخطوط المتوازية على شريحة LiDEP. في برنامج المجهر الرقمي ، اضبط طول الفيديو على ثلاث دقائق.
اضبط مؤقت المختبر على دقيقتين و 30 ثانية. بمجرد أن تصبح الخلايا ثابتة في القناة الدقيقة لشريحة LiDEP ، اضغط على ابدأ في برنامج المجهر الرقمي لبدء عملية تسجيل الفيديو. بعد 10 ثوان ، اضغط على الزر تشغيل لإخراج قناة مولد الوظيفة لتطبيق المجال الكهربائي للتيار المتردد واضغط على بدء المؤقت.
راقب سلوك DEP للخلية من خلال المجهر الرقمي ومنع الاهتزاز أو الحركة حول الإعداد. بمجرد أن يرن المؤقت ، اضغط على الزر تشغيل لخرج قناة مولد الوظيفة الذي يقوم بإيقاف تشغيل خرج القناة ولم يعد يتم توفير المجال الكهربائي للتيار المتردد من خلال الأقطاب الكهربائية. أوقف تسجيل الفيديو بعد ثلاث دقائق واحفظه للتحليل المستقبلي.
ماصة الخلايا من نهاية مخرج شريحة LiDEP عن طريق دفع 60 ميكرولترا ببطء من المخزن المؤقت DEP مع 0.5٪ BSA في القناة الدقيقة وجمع المخرج في نفس الوقت. استمر حتى يكون هناك القليل من الخلايا أو لا توجد خلايا في القناة الدقيقة وكرر DEP مع جميع الترددات كما هو موضح. تم تحديد استجابات DEP من حيث السرعة ل HMSCs ونسبة صلاحيتها.
أظهرت قياسات استجابات DEP الإيجابية عند خمسة ، 10 ، amd 20 الجهد من الذروة إلى الذروة أو VPP أن الخلايا تحركت بسرعة متوسطة تبلغ 0.025 و 0.036 و 0.051 ميكرومتر في الثانية على التوالي. أظهرت نتائج الجدوى ل HMSCs بعد تجربة قوة DEP أن الفولتية العالية أدت عموما إلى انخفاض صلاحية الخلية مع 57٪ من الخلايا قابلة للحياة عند 20 VPP. تم اختيار أقطاب كهربائية ملونة باللون الأبيض والأصفر والأحمر والأزرق لهذه الدراسة ، لكن الإضاءة من خلال شريحة عمق LiDEP تأثرت بالطبقة الموصلة للصور ، والتي كان لها لون برتقالي أحمر.
ومن ثم ، ظهر القطب الأبيض المسقط باللون الأصفر مع جزء داخلي أبيض ، وظهر القطب الأحمر باللون البرتقالي مع مخطط أحمر ، وظهر القطب الأزرق باللون الأخضر الفاتح. تشير هذه الظاهرة إلى أن الأصفر والأبيض كان لهما أقوى مجال DEP بينما كان الأزرق والأحمر أضعف. تم قياس استجابات DEP ل HMCs باستخدام LiDEP في محلل عمق ثلاثي عند 10 VPP.
مع LiDEP ، كان هناك اضمحلال في استجابة DEP الإيجابية من 30 كيلو هرتز إلى 20 ميغا هرتز. من المحلل الثلاثة ، زادت الخلايا في DEP الإيجابي من 37 إلى 255 كيلو هرتز وانخفضت في DEP الإيجابي من 1،772 كيلو هرتز إلى 20 ميغا هرتز. مكونان مهمان في هذه الطريقة هما مصدر ضوء قوي واتصال كهربائي قوي لضمان إنتاج المجال الكهربائي ومعالجة الخلايا.
لاحظنا دوران الخلية استجابة للأقطاب الكهربائية الافتراضية. وبالتالي ، فإن الدوران الكهربائي هو طريقة أخرى لتحليل الخلايا يمكن إجراؤها. سيوفر الدوران الكهربائي معلومات حول عدم تجانس HMSCs والمجموعات الفرعية النادرة.
