إن تصنيع الجسيمات النانوية المغلفة بالدهون باستخدام طريقة الحقن السريع يوفر نظام تسليم دواء مستقر لعلاج السرطان. هذه التقنية هي تقنية بسيطة وسريعة وقابلة للتطوير وقابلة للاستنساخ لتصنيع الجسيمات النانوية التي تغلف الأدوية المسببة للدهر. هذه التقنية قابلة للتطبيق لاختلاق جسيمات نانوية تشخيصية وعلاجية من المواد الهيدروسيبية التي يمكن استخدامها بشكل فعال في العديد من حالات المرض.
ويمكن استخدام تقنية التصنيع هذه، إلى جانب تقنية DLS، لدراسة نوات ونمو المواد الناعورة، مثل الدهون والبروتينات والبوليمرات. معرفة الخصائص الكيميائية الفيزيائية للمادة المخدرات الخاصة بك أمر بالغ الأهمية قبل تصنيع الجسيمات النانوية. أيضا، تأكد من استخدام التركيزات الصحيحة من الدهون طلاء.
إن العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية لإظهار بساطة تقنية التصنيع وإظهار التسليم الناجح للدواء كجسيمات نانوية للخلايا. يجب اتخاذ الاحتياطات عند العمل مع الكلوروفورم والفورمالديهايد، والعمل تحت غطاء الدخان مطلوب. للبدء، الاستغناء 2.4 ملليلتر من 250 محلول مخزون فلكارينديول ميكرومولار حل في 70٪ الإيثانول في قارورة التلألؤ.
باستخدام مركز العينة، يتبخر الكسر السائل لمدة أربع ساعات تقريبًا للحصول على الفكارينديول الجاف. باستخدام مركز العينة، تسليم الغاز على العينة في درجة حرارة الغرفة لتركيز العينة. مرة واحدة المجففة، إضافة المكونات المعروضة هنا إلى قارورة التلألؤ في غطاء الدخان، والتأكد من تنظيف الحقنة مع الكلوروفورم بعد إضافة كل مكون لتجنب التلوث عبر.
ثم أغلق على الفور قارورة تحتوي على الدهون بحيث لا يتبخر المذيب وبالتالي تعديل التركيز. التفاف القارورة مع رقائق الألومنيوم لحماية DiI من الضوء وترك العينة بين عشية وضحاها في مجفف لتبخر الكلوروفورم. في اليوم التالي، قم بحل العينة المجففة في الإيثانول المطلق لجعل حجم النهائي من 1.2 ملليلتر.
يمثل هذا الحل المرحلة العضوية. خذ قارورة زجاجية 12 ملليلتر وملأها بتسعة ملليلترات من الماء النقي. ثم تضاف برغوث مغناطيسي في القارورة التي تحتوي على تسعة ملليلتر من الماء.
ضع القارورة على مُحرك مغناطيسي وحركه عند 500 دورة في الدقيقة. المقبل إرفاق حقنة زجاجية ملليلتر واحد إلى نظام الاستغناء وسحب الكلوروفورم ببطء داخل وخارج الحقنة الزجاجية على الأقل 10 مرات. الاستغناء عن الكلوروفورم في جامع النفايات في كل مرة.
تنظيف الحقنة مع الكلوروفورم يساعد على تجنب أي تلوث. الآن رئيس حقنة مع الإيثانول. فتيلة يستبدل المذيب القديم وكذلك يزيل أي فقاعات الهواء.
باستخدام الحقنة ، يُفطن مليلتر واحد من المرحلة العضوية ، وأدخل الحقنة في القارورة الزجاجية حتى منتصف علامة الماء التسعة ملليلتر. الحفاظ على ثابت في منتصف القارورة، وحقن الحل في 833 ميكرولترس في الثانية عن طريق الضغط على زر الاستغناء على نظام الاستغناء. وهذا يولد 10 ميكرولترات من 50 جسيمات نانوية مغلفة الدهون الدقيقةمولار من فالكارينديول في 10٪ الإيثانول.
وقد تم العثور على هذه السرعة الحقن لتحقيق أجود الجسيمات النانوية مع توزيع حجم الجسيمات الضيقة. أثناء الحقن ، من المهم التأكد من إدخال الإبرة في المركز ، ثابتة ومستقيمة. مباشرة بعد الحقن، وإزالة القارورة من المزال ونقل العينة إلى قارورة 50 ملليلتر أسفل مستديرة.
هجوم على قارورة إلى المبخر الدوار، وتتبخر ملليلتر واحد من المذيبات العضوية في درجة حرارة الغرفة. كن حذرا لتجنب تشكيل فقاعة الزائدة. نقل تعليق الجسيمات النانوية من القارورة إلى قارورة زجاجية أخرى 12 ملليلتر.
تأكد من أن وحدة التخزين هي تسعة ملليلتر، ثم تقسيم العينة في قارين زجاج 12 ملليلتر. ثم إضافة 0.5 ملليلتر من المياه النقية جدا في واحدة من قوارير و 0.5 ملليلتر من الفوسفات 10X المخزنة المالحة في القارورة الأخرى. قم بتشغيل أداة تشتت الضوء الرقمي، واضبط درجة الحرارة المطلوبة إلى 20 درجة مئوية حتى تستقر.
ثم تعيين المعلمات الصك كما هو مبين هنا. ملء cuvette البلاستيك مع ملليلتر واحد من تعليق الجسيمات النانوية، وبدء القياس. الإبلاغ عن حجم قياس اعتمادا على المذيبات التي تم استخدامها.
بذور ما يقرب من 50،000 الخلايا على 1.5 زلة غطاء عقيمة وضعت في لوحة ستة جيدا للحصول على كثافة الخلية من حوالي 30٪، ثم إضافة ثقافة المتوسطة من أجل أن يكون حجم النهائي من ثلاثة ملليلتر في كل بئر. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في ظل ظروف الثقافة القياسية. في اليوم التالي، إضافة ثلاثة ميكرولترات من محلول الجسيمات النانوية لتركيز فالكارينديول النهائي من خمسة ميكرومولار.
ثم ارجع الخلايا إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة من العلاج، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، ومن ثم إصلاحها في الفورمالديهايد 4٪ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت، قم بإضفاء الشرعية على الخلايا بنسبة 0.1٪ Triton X-100 لمدة 30 دقيقة.
ثم غسلها مرتين مع برنامج تلفزيوني، وصمة عار لهم مع 250 ميكرولترات من 300 نانومولار DAPI لمدة خمس دقائق، وحمايتها من الضوء. ضع زلة الغلاف على شريحة باستخدام قطرة من برنامج تلفزيوني. انتقل إلى ذاتي 150x ، ونقل الشريحة إلى مرحلة مجهر الفلورانس واسع المجال مجهز بكاميرا CCD الإلكترونية مضروبة.
خلايا الصورة باستخدام قناة GFP-LP. بالإضافة إلى ذلك، تحقق من امتصاص الجسيمات النانوية في الخلايا عن طريق التقاط صور المجهر الكونكنتال باستخدام هدف زيت 63x مع فتحة رقمية قدرها 1.4. صورة DiI باستخدام ليزر الأرجون في 514 نانومتر وDAPI باستخدام ليزر فوتون اثنين في 780 نانومتر.
وأظهرت الجسيمات النانوية غير المصقولة من فالكارينديول التي تشكلت في الماء وتقاس في برنامج تلفزيوني تعدداً عالياً، مع مؤشر PD من 0.571. وتشير هذه القيمة إلى التوزيع الواسع وغير المُتّمَس لأحجام الجسيمات. في المقابل، كانت الجسيمات النانوية المغلفة بالدهون من فالكارينديول المفبركة في هذا الفيديو من 74.1 نانومتر مع مؤشر تعدد التخصصات من 0.182، وأشار إلى توزيع أحادية نسبيا وموحدة من أحجام الجسيمات.
كملاحظة أولى للجسيمات النانوية داخل الخلايا ، تم الحصول على صور المجهر epifluorescence بعد 24 ساعة من العلاج. تم تصور الجسيمات النانوية على أنها نقاط بيضاء ومشرقة ، ويمكن افتراض أن الجسيمات النانوية كانت موجودة داخل الخلايا المحيطة بالنواة. للتحقق من أن جسيمات نانوية فالكارينديول قد دخلت الخلايا، تم إجراء المجهر confocal على الخلايا أيضا.
يظهر عدد كبير من الجسيمات النانوية هنا، متناثرة في السيتوبلازم في كل خلية. وتظهر هذه النتائج أن الجسيمات النانوية بمثابة نظام تسليم المخدرات مستقرة للفالكارينديول. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم حقن الحل بسرعة الحقن الصحيحة ، مع الحفاظ على البذر ثابتًا ، في المركز ، لضمان الخلط السليم.
يمكن استخدام هذا الإجراء لأي دواء مُزَمِر للماء لصياغة جسيمات نانوية علاجية أو لعوامل التصوير لصياغة جسيمات نانوية تشخيصية يمكن استخدامها في حالات مرضية مختلفة، مثل السرطان. وقد مكنت هذه التقنية من إجراء المزيد من البحوث حول الآلية التي يتم من خلالها تناول الجسيمات النانوية من قبل الخلايا ، وكذلك تصوير الخلايا الحية ودراسة تأثير مكافحة الانسان للدواء.
