بالنسبة للدراسة الحالية ، تمت الموافقة على التجارب على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو وتم إجراؤها وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تم استخدام الفئران البالغة من العمر 8-12 أسبوعا C57BL / 6 من الذكور والإناث (المرباة في المنزل) هنا.
1. إعداد عينة DRG
<ol><li>تخدير الفئران بنسبة 2.5٪ Avertin (انظر جدول المواد). ضمان التخدير الكافي من خلال عدم الاستجابة للتحفيز المؤلم. قم بتغذية عبر القلب بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) متبوعا ب 4٪ فورمالديهايد ، كما هو موضح سابقا14،15،16.</li>
	<li>تشريح أنسجة DRG من الحبل الشوكي ، كما هو موضح سابقا14،15،16.</li>
	<li>بعد إصلاح DRGs تشريح في 4 ٪ الفورمالديهايد لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>ضع DRGs في 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني عند 4 درجات مئوية طوال الليل.</li>
	<li>تحضير درجة حرارة القطع المثلى للقاعدة (OCT)<ol><li>أضف مركب OCT (انظر جدول المواد) لتغطية السطح العلوي لكتلة الألومنيوم وقم بتجميده عند -20 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق (الشكل 1 أ).</li>
		<li>اقطع الجزء العلوي من OCT باستخدام cryostat (انظر جدول المواد) بسمك 30 ميكرومتر حتى يصبح سطحه مسطحا مثل OCT الأساسي (الشكل 1B).</li>
		<li>ضع علامة في الجزء السفلي (موضع الساعة السادسة) من OCT الأساسي لتحديد اتجاهه ، قبل إزالة كتلة الألومنيوم من cryostat (الشكل 1C).</li>
		<li>في الخطوات التالية ، احتفظ بالعلامة عند موضع الساعة السادسة للحفاظ على نفس الاتجاه ، مما قد يؤدي إلى الحصول على المزيد من أقسام عينة DRG. ملاحظة: إذا فقد الاتجاه وتم قطع عينة DRG بزاوية مختلفة ، فلا يمكن قطع عينة DRG بالكامل من أعلى إلى أسفل ، مما سيترك بعض العينات متروكة على قاعدة OCT وتضيع ، حيث سيتم مواجهة OCT الأساسي أثناء محاولة قطع عينة DRG (الشكل 1C).</li>
	</ol></li>
	<li>إجراء تضمين OCT ل DRGs<ol><li>جفف أنسجة DRG قبل وضعها على OCT.<ol><li>قبل إضافة DRG إلى الكتلة ، تأكد من إزالة محلول السكروز / PBS بنسبة 30٪ حول العينة.</li>
			<li>جفف عينة DRG عن طريق وضعها على طبق بتري جاف (الشكل 2 أ) ونقلها من مكان إلى آخر مرتين أو ثلاث مرات باستخدام ملاقط جافة (الشكل 2 ب).</li>
			<li>جفف الملقط بمنديل خال من النسالة قبل نقل عينة DRG أخرى (الشكل 2C).</li>
		</ol></li>
		<li>ضع DRG الجاف على القاعدة OCT.<ol><li>باستخدام الملقط الجاف ، ضع DRG الجاف على قاعدة OCT عند موضع الساعة 12 (الشكل 1 د).</li>
			<li>احتفظ بما لا يقل عن 5 مم بين الحافة العلوية ل DRG والحافة العلوية للقاعدة OCT.</li>
			<li>ضع الجزء الظهري من DRG في موضع الساعة 12 والجزء البطني في موضع الساعة السادسة (الشكل 1D).</li>
		</ol></li>
		<li>قم بتضمين أنسجة DRG مع OCT.<ol><li>أضف المزيد من OCT لتغطية عينة DRG بأكملها في شكل دائري أو بيضاوي ، مع وجود DRG في المنتصف (الشكل 1E).</li>
			<li>تأكد من أن الحافة العلوية ل OCT تغطي DRG عند الحافة العلوية للقاعدة OCT (الشكل 1F) ، لأن هذا يسهل نقل القسم إلى الشريحة الزجاجية (الشكل 3 أ). ملاحظة: إذا كان غطاء OCT في منتصف OCT الأساسي ، فإن الحافة العلوية للقاعدة OCT ستسد الشريحة الزجاجية لتجميع القسم (الشكل 3B).</li>
			<li>قم بتجميد عينة الغطاء OCT و DRG عند -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أخرى (الشكل 1G). لا تقم بقص OCT حول عينة DRG.</li>
			<li>اقطع الجزء العلوي من الغطاء OCT بسمك 30 ميكرومتر حتى يصبح DRG مرئيا.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. التقسيم بالتبريد ل DRG
<ol><li>قم بتغيير سمك مقطع cryostat إلى 12 ميكرومتر لقطع أقسام DRG على الشريحة (الشكل 1H).</li>
	<li>أمسك قسم OCT في الأسفل بفرشاة رسم صغيرة مبردة إلى -20 درجة مئوية. ملاحظة: من المهم عدم قطع القسم بأكمله تماما ، ولكن ترك 1-3 مم غير مقطوع (الشكل 1I).</li>
	<li>استخدم نهاية الملقط بدرجة حرارة الغرفة للمس الجزء السفلي (موضع الساعة السادسة) برفق من القسم بحيث يلتصق بسطح المنصة (الشكل 1J). هذا يمنع القسم من التقويس مرة أخرى في لفة ، مما يجعل من الصعب جمع القسم على الشريحة. ملاحظة: عندما يلتصق الجزء السفلي من القسم بسطح المنصة ، ولا يزال الجزء العلوي من القسم متصلا بالغطاء OCT ، يكون القسم في شكل مسطح (الشكل 1K) ، مما يسهل جمع القسم على الشريحة.</li>
	<li>خذ شريحة زجاجية مشحونة (انظر جدول المواد) وضع الشريحة ببطء فوق القسم. بمجرد أن يبدأ القسم في الالتصاق بالشريحة ، اسحب الشريحة برفق للخلف (الشكل 1L).</li>
	<li>اتبع نفس العملية للحصول على المزيد من أقسام DRG على الشريحة دون تداخل الأقسام (الشكل 1M). تأكد من عدم وضع قسم DRG جديد فوق OCT لقسم DRG آخر (الشكل 4) ، لأن هذا القسم لا يمكن أن يبقى جيدا على الشريحة ويمكن غسله أثناء عملية تلطيخ الكيمياء المناعية.</li>
</ol>3. تلطيخ نيسل لقسم DRG على الشريحة الزجاجية
<ol><li>اغسل الأقسام لمدة 10 دقائق في PBS بالإضافة إلى 0.1٪ Triton X-10. ثم اغسل الأقسام مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>ضع بقعة 1: 300 Nissl (انظر جدول المواد) على الشريحة واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>اغسل القسم باستخدام PBS بالإضافة إلى 0.1٪ Triton X-100. ثم ، اغسل الأقسام مرتين باستخدام PBS لمدة 5 دقائق ، ثم لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>قم بتطبيق 4 ′،6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) فلوروماونت-G (انظر جدول المواد) لتغطية الأقسام بغطاء غطاء.</li>
</ol>

الفأر الظهري الجذر العقدة التقسيم بالتبريد

<ol>
	<li>Guan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injured+sensory+neuron-derived+CSF1+induces+microglial+proliferation+and+DAP12-dependent+pain.">Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+root+ganglion+macrophages+contribute+to+both+the+initiation+and+persistence+of+neuropathic+pain.">Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain.</a> Nature Communications. 11 (1), 264 (2020).</li><li>Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+its+role+in+pain.">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).</li><li>Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+of+dorsal+root+ganglion+neurons:+study+of+oxytocin+expression.">Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression.</a> Molecular Brain. 15 (1), 44 (2022).</li><li>Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuro-immune+interactions+in+chronic+pain:+implications+for+clinical+practice.">The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice.</a> Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).</li><li>Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+characteristics+of+the+dorsal+root+ganglion+as+a+target+for+neuromodulation.">Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation.</a> Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).</li><li>Chen, X. J., Sun, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+circuit+mechanisms+of+itch.">Central circuit mechanisms of itch.</a> Nature Communications. 11 (1), 3052 (2020).</li><li>Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+views+on+inflammatory+pain+mechanisms:+TRPing+over+innate+and+microglial+pathways.">Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways.</a> F1000Research. , (2016).</li><li>Boadas-Vaello, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroplasticity+of+ascending+and+descending+pathways+after+somatosensory+system+injury:+reviewing+knowledge+to+identify+neuropathic+pain+therapeutic+targets.">Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets.</a> Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).</li><li>Guha, D., Shamji, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+root+ganglion+in+the+pathogenesis+of+chronic+neuropathic+pain.">The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain.</a> Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).</li><li>Shorrock, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UBA1/GARS-dependent+pathways+drive+sensory-motor+connectivity+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy.</a> Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).</li><li>Sleigh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trk+receptor+signaling+and+sensory+neuron+fate+are+perturbed+in+human+neuropathy+caused+by+Gars+mutations.">Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).</li><li>Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+somatosensory+neuron+involvement+in+the+SOD1(G93A)+mouse+model.">Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model.</a> Scientific Reports. 12 (1), 7600 (2022).</li><li>Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+for+rapid+dissection+of+mouse+dorsal+root+ganglia+from+defined+spinal+levels.">A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels.</a> BMC Research Notes. 13 (1), 302 (2020).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release.">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).</li><li>Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+dorsal+root+ganglion+neuron+cell+lines.">Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184 (2020).</li><li>Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+transcriptional+signatures+of+neuropathic+pain.">Common transcriptional signatures of neuropathic pain.</a> Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).</li><li>Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+changes+in+dorsal+root+ganglia+following+peripheral+nerve+injury:+roles+in+inflammation,+cell+death+and+nociception.">Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception.</a> Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).</li><li>Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+and+chemokine+regulation+of+sensory+neuron+function.">Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+outgrowth,+neuropeptides+expression+and+receptors+tyrosine+kinase+phosphorylation+in+3D+organotypic+cultures+of+adult+dorsal+root+ganglia.">Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia.</a> PLoS One. 12 (7), e0181612 (2017).</li><li>Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+nature+of+dorsal+root+ganglion+neurons:+Linking+structure+with+polarity+and+function.">The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function.</a> Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).</li><li>Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+sensory+afferent+compartments+in+health+and+disease.">The structure of sensory afferent compartments in health and disease.</a> Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).</li><li>Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+transcriptomic+analysis+of+human+dorsal+root+ganglion+neurons.">Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons.</a> eLife. 10, e71752 (2021).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Hunt, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRGquant:+A+new+modular+AI-based+pipeline+for+3D+analysis+of+the+DRG.">DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG.</a> Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497 (2022).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يوفر هذا البروتوكول إجراء سهلا خطوة بخطوة لتقسيم cryostat للماوس DRG للحصول على أقسام DRG عالية الجودة على الشرائح بشكل موثوق. هناك أربع خطوات حاسمة في هذا البروتوكول. أولا ، يجب أن تكون عينة DRG والملاقط جافة قبل وضع عينة DRG على OCT الأساسي. أي سائل يحيط بعينة DRG سيشكل قشرة جليدية حولها ، مما يؤدي إلى ...

تحتوي العقدة الجذرية الظهرية (DRG) على الخلايا العصبية الحسية الأولية ، والبلاعم النسيجية ، والخلايا الساتلية التي تحيط بالخلايا العصبية الحسية الأولية1،2،3،4. إنه هيكل تشريحي رئيسي في معالجة الإشارات غير الضارة والضارة ، ويلعب أدوارا حاسمة في الألم والحكة واضطرابات الأعصاب الطرفية المختلفة5،6،7،8،9،10،11،12،13. على الرغم من تطوير عدة طرق لتشريح أنسجة DRG من الحبل الشوكي للفأر14،15،16 ، إلا أن التشريح بالتبريد لأنسجة DRG لا يزال يمثل تحديا لأن أنسجة DRG صغيرة جدا ، وتميل أقسام cryostat من عينات DRG إلى الانحناء إلى لفات ، مما يجعل من الصعب نقل أقسام cryostat بشكل صحيح إلى شرائح زجاجية. ومع ذلك ، فإن التشريح بالتبريد المناسب لأنسجة DRG أمر بالغ الأهمية لدراسات الكيمياء الهيستولوجية المناعية وهيكل الخلايا العصبية الحسية DRG17،18،19،20،21،22،23. علاوة على ذلك ، نظرا لأن نتائج تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية قد كشفت عن عدم التجانس الملحوظ للخلايا العصبية الحسية DRG في كل من البشر24 والفئران25 ، فإن التقسيم بالتبريد المناسب لأنسجة DRG أمر بالغ الأهمية للتحقيق في الدور الوظيفي لخلايا DRG المختلفة في مختلف الحالات الفسيولوجية والمرضية.
على الرغم من أن تقنية إزالة الأنسجة قد تم تطبيقها للتحقيق في إعادة بناء 3D ل DRG26 كتقنية بديلة للتشريح بالتبريد DRG ، فإن تقنية إزالة الأنسجة تستغرق وقتا طويلا وعمالة. وبالمقارنة ، فإن التقسيم بالتبريد ل DRG سريع وسهل الأداء نسبيا ، وبالتالي يظل تقنية رئيسية للكيمياء المناعية ودراسات بنية DRG ومناطق أخرى من الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإن الحصول على أقسام كريوستات عالية الجودة وسليمة ومسطحة على شرائح زجاجية لا يزال يمثل تحديا في أبحاث علم الأعصاب بسبب حجم العينة الصغير للأنسجة ، مثل DRG وبعض مناطق الدماغ ، ولا توجد مقالة تصف البروتوكول الأمثل في هذه المرحلة للتشريح بالتبريد لعينات الأنسجة صغيرة الحجم ، مثل DRGs الفأر.
يوفر هذا البروتوكول تقنية سهلة خطوة بخطوة لتقسيم cryostat للماوس DRG للحصول بشكل موثوق على أكبر عدد ممكن من أقسام DRG عالية الجودة على الشرائح لدراسات DRG اللاحقة. في حين أن هذه التقنية مصممة خصيصا للتشريح بالتبريد لعينات DRG ، إلا أنه يمكن استخدامها للتشريح بالتبريد لمختلف الأنسجة الأخرى ذات حجم العينة الصغير.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Avertin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T48402-25G</td>
			<td>Anesthetize animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia&#160;Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1910</td>
			<td>Hold the OCT section at the bottom&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergo Tweezers</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S95310</td>
			<td>Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o&#8217;clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td>To collect the DRG section&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pens</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>133794</td>
			<td>&#160;Mark the orientation of base OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scigen&#160;Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>&#160;23730571</td>
			<td>Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a procedure for mouse dorsal root ganglion cryosectioning

تعد أقسام العقدة الجذرية الظهرية للفأر (DRG) عالية الجودة ضرورية لتلطيخ الكيمياء المناعية المناسبة ودراسات RNAscope في البحث عن الألم الالتهابي والاعتلال العصبي والحكة بالإضافة إلى الحالات العصبية الطرفية الأخرى. ومع ذلك ، لا يزال من الصعب الحصول باستمرار على أقسام كريوستات عالية الجودة وسليمة ومسطحة على شرائح زجاجية بسبب حجم العينة الصغير لأنسجة DRG. حتى الآن ، لا توجد مقالة تصف البروتوكول الأمثل للتشريح بالتبريد DRG. يقدم هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لحل الصعوبات التي تواجهها بشكل متكرر والمرتبطة بالتقسيم بالتبريد DRG. تشرح المقالة المقدمة كيفية إزالة السائل المحيط من عينات أنسجة DRG ، ووضع أقسام DRG على الشريحة التي تواجه نفس الاتجاه ، وتسطيح الأقسام الموجودة على الشريحة الزجاجية دون التقويس. على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تم تطويره للتشريح بالتبريد لعينات DRG ، إلا أنه يمكن تطبيقه على التشريح بالتبريد للعديد من الأنسجة الأخرى ذات حجم العينة الصغير.

The dorsal root ganglion (DRG) contains the primary sensory neurons, the tissue macrophages, and the satellite cells that surround the primary sensory neurons1,2,3,4. It is a key anatomic structure in processing innocuous and noxious signals, and plays critical roles in pain, itch, and various peripheral nerve disorders5,6,7,8,9,10,11,12,13. Although several methods have been developed to dissect DRG tissue from the mouse spinal cord14,15,16, cryosectioning of the DRG tissue remains challenging as the DRG tissue is quite small, and cryostat sections of DRG samples tend to curve into rolls, making it difficult to properly transfer the cryostat sections onto glass slides. However, proper cryosectioning of the DRG tissue is crucial for immunohistochemistry studies and the structure of DRG sensory neurons17,18,19,20,21,22,23. Moreover, as single-cell RNA sequencing results have revealed the remarkable heterogeneity of DRG sensory neurons in both humans24 and mice25, proper cryosectioning of DRG tissue is critical for investigating the functional role of different DRG cells in various physiological and pathological conditions.
Although the tissue-clearing technique has been applied to investigate the 3D reconstruction of the DRG26 as an alternative technique of cryosectioning the DRG, the tissue-clearing technique is time- and labor-consuming. In comparison, cryosectioning of the DRG is quick and relatively easy to perform, and thus it remains to be a key technique for immunohistochemistry and structure studies of the DRG and other regions of the central nervous system. However, obtaining high-quality, intact, and flat cryostat sections onto glass slides remains to be a challenge in neuroscience research because of the tiny sample size of tissues, like the DRG and certain brain regions, and there is no article describing the optimal protocol at this point for cryosectioning small-sized tissue samples, such as mouse DRGs.
This protocol provides an easy, step-by-step technique for cryostat sectioning of the mouse DRG to reliably obtain as many high-quality DRG sections on the slides for subsequent DRG studies. While specifically designed for cryosectioning DRG samples, this technique can potentially be used for cryosectioning various other tissues with a small sample size.

تسليط الضوء على المؤلف: إجراء للفأر الظهري الجذر العقدة بالتبريد  

إجراء للتشريح بالتبريد لجذر الجذر الظهري للفأر

It remains a challenge to consistently obtain high-quality, intact, and flat mouse dorsal root ganglion cryostat sections. The research aims to answer how to acquire ideal mouse dorsal root ganglion cryostat section. This protocol provides an easy step-by-step technique for cryostat section of the mouse DRG to high quality, intact, and flat mouse DRG cryostat sections.This presented article explains how to remove surrounding liquid from the mouse DRG sample tissue, placing the DRG sections on the slides facing the same orientation, and flatten the DRG sections without curving up. One major challenge is that the OCT sections of mouse DRG tend to curve into a roll, making it difficult to place onto the glass slide. It is also challenging to acquire sufficient sections from one sample due to the small size of the mouse DRG.

جمعت الدراسة الحالية حوالي 16 قسما مستمرا وعالي الجودة DRG من ماوس واحد L4 DRG. كانت الأقسام التي تم الحصول عليها دون أي تشويه. يوضح الشكل 1 الإجراء خطوة بخطوة للتشريح بالتبريد. يوضح الشكل 2 إزالة السائل الزائد من أقسام الأنسجة. يتم تسليط الضوء على عملية تضمين OCT ل?...

Watch this Scientific Journal Video about A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning at JoVE.com

يظهر هنا التطوير للحصول باستمرار على أقسام تبريد العقدة الجذرية الظهرية عالية الجودة.

High-quality mouse dorsal root ganglion (DRG) cryostat sections are crucial for proper immunochemistry staining and RNAscope studies in the research of ...

لا يزال من الصعب الحصول باستمرار على أقسام تجميد جذر جذر الفأر الظهرية عالية الجودة وسليمة ومسطحة. يهدف البحث إلى الإجابة عن كيفية الحصول على قسم تجميد العقدة الجذرية الظهرية للفأر المثالي. يوفر هذا البروتوكول تقنية سهلة خطوة بخطوة لقسم cryostat من الماوس DRG إلى أقسام DRG cryostat عالية الجودة وسليمة ومسطحة للماوس.تشرح هذه المقالة المقدمة كيفية إزالة السائل المحيط من أنسجة عينة DRG للفأر ، ووضع أقسام DRG على الشرائح التي تواجه نفس الاتجاه ، وتسطيح أقسام DRG دون التقويس. يتمثل أحد التحديات الرئيسية في أن أقسام OCT من الماوس DRG تميل إلى الانحناء إلى لفة ، مما يجعل من الصعب وضعها على الشريحة الزجاجية. من الصعب أيضا الحصول على أقسام كافية من عينة واحدة نظرا لصغر حجم الماوس DRG.

a-procedure-for-mouse-dorsal-root-ganglion-cryosectioning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning

4.1K Views.  Capital Medical University. لا يزال من الصعب الحصول باستمرار على أقسام تجميد جذر جذر الفأر الظهرية عالية الجودة وسليمة ومسطحة. يهدف البحث إلى الإجابة عن كيفية الحصول على قسم تجميد العقدة الجذرية الظهرية للفأر المثالي. يوفر هذا البروتوكول تقنية سهلة خطوة بخطوة لقسم cryostat من الماوس DRG إلى أقسام DRG cryostat ع?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: إجراء للفأر الظهري الجذر العقدة بالتبريد  

High-quality mouse dorsal root ganglion (DRG) cryostat sections are crucial for proper immunochemistry staining and RNAscope studies in the research of inflammatory and neuropathic pain, itch, as well as other peripheral neurological conditions. However, it remains a challenge to consistently obtain high-quality, intact, and flat cryostat sections onto glass slides because of the tiny sample size of the DRG tissue. So far, there is no article describing an optimal protocol for DRG cryosectioning. This protocol presents a step-by-step method to resolve the frequently encountered difficulties associated with DRG cryosectioning. The presented article explains how to remove the surrounding liquid from the DRG tissue samples, place the DRG sections on the slide facing the same orientation, and flatten the sections on the glass slide without curving up. Although this protocol has been developed for cryosectioning the DRG samples, it can be applied for the cryosectioning of many other tissues with a small sample size.

Presented here is the development for consistently acquiring high-quality dorsal root ganglion cryostat sections.

Dorsal Root Ganglion (DRG) Sample Preparation for Cryosectioning

Begin by post-fixing the DRG tissue dissected from the spinal cord of the anesthetized mouse in 4%formaldehyde for three hours at room temperature. Then, incubate the tissue in 30%sucrose in PBS at four degrees Celsius overnight. Next, prepare the base OCT by adding the OCT compound and covering the top surface of the aluminum block.Freeze the covered aluminum block at minus 20 degrees Celsius for five to 10 minutes. Cut off the top of the OCT at 30-micrometer thickness using the cryostat, until its surface is as flat as the base OCT. Mark the bottom of the base OCT at the 6:00 position, before taking the aluminum block off the cryostat.To perform OCT embedment of DRGs, dry the DRG tissue by placing it on a dry Petri dish and moving it from one location to another two or three times with the dry tweezers. Then, place the dry DRG onto the OCT base at the 12:00 position, using dry tweezers. Ensure to keep at least five millimeters distance between the upper-edge of the DRG and the upper-edge of the base OCT, with the dorsal part at the 12:00 position, and the ventral part at the 6:00 position.Next, add OCT in a round or oval shape to embed the entire DRG tissue with the DRG in the center. Freeze the cover OCT and DRG sample at minus 20 degrees Celsius for five minutes. Once done, cut off the top of the cover OCT at a 30-micrometer thickness until the DRG is visible.

تحضير عينة العقدة الجذرية الظهرية (DRG) للتشريح بالتبريد

Cryosectioning of the Dorsal Root Ganglion (DRG)

Begin the cryosectioning by holding the optimal cutting temperature DRG section at the bottom, using a small paint brush, pre-chilled at 20 degrees Celsius. Gently touch the bottom of the section using the end of a room temperature tweezer so that it sticks to the platform surface. Next, slowly place a charged glass slide over the section.As soon as the section sticks to the slide, gently pull the slide backward. Follow the same process to get more DRG sections onto the slide without overlapping the sections. The proper placement of the DRG sections on the glass slides is seen where the tissues are not overlapping the DRG section and the OCT of other DRG sections.The confocal fluorescence microscopy image demonstrated the quality of the DRG sections obtained with this protocol. With this technique, the immunohistochemistry studies of DRG can be performed using different antibodies.