Für die vorliegende Studie wurden die Tierversuche vom UCSF Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Hier wurden erwachsene, 8-12 Wochen alte männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse (selbst gezüchtet) verwendet.
1. DRG-Probenvorbereitung
<ol><li>Betäuben Sie die Mäuse mit 2,5% Avertin (siehe Materialtabelle). Sorgen Sie für eine ausreichende Anästhesie, indem Sie nicht auf schmerzhafte Stimulation reagieren. Die Tiere werden transkardial mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefolgt von 4% Formaldehyd perfundiert, wie zuvor beschrieben14,15,16.</li>
	<li>DRG-Gewebe aus dem Rückenmark sezieren, wie zuvor beschrieben14,15,16.</li>
	<li>Die präparierten DRGs werden 3 h lang bei Raumtemperatur in 4%igem Formaldehyd nachfixiert.</li>
	<li>Die DRGs werden über Nacht in 30%iger Saccharose in PBS bei 4 °C eingelegt.</li>
	<li>Vorbereiten der optimalen Schnitttemperatur (OCT)<ol><li>Fügen Sie die OCT-Mischung (siehe Materialtabelle) hinzu, um die Oberseite des Aluminiumblocks zu bedecken, und frieren Sie sie bei -20 °C für 5-10 Minuten ein (Abbildung 1A).</li>
		<li>Schneiden Sie die Oberseite des OCT mit dem Kryostaten (siehe Materialtabelle) mit einer Dicke von 30 μm ab, bis seine Oberfläche flach ist wie das Basis-OCT (Abbildung 1B).</li>
		<li>Machen Sie eine Markierung an der Unterseite (Sechs-Uhr-Position) des Basis-OCT, um seine Ausrichtung zu markieren, bevor Sie den Aluminiumblock vom Kryostaten entfernen (Abbildung 1C).</li>
		<li>Halten Sie in den folgenden Schritten die Markierung auf der Sechs-Uhr-Position, um die gleiche Ausrichtung beizubehalten, was dazu führen kann, dass Sie mehr Abschnitte der DRG-Probe erhalten. HINWEIS: Wenn die Orientierung verloren geht und die DRG-Probe in einem anderen Winkel geschnitten wird, kann die DRG-Probe nicht vollständig von oben nach unten geschnitten werden, wodurch einige Proben auf dem Basis-OCT ausgelassen und verschwendet werden, da das Basis-OCT beim Versuch, das DRG-Sample zu schneiden, angetroffen wird (Abbildung 1C).</li>
	</ol></li>
	<li>OCT-Einbettung von DRGs durchführen<ol><li>Trocknen Sie das DRG-Gewebe ab, bevor Sie es auf das OCT legen.<ol><li>Bevor Sie das DRG auf den Block geben, stellen Sie sicher, dass die 30%ige Saccharose/PBS-Lösung um die Probe herum entfernt wird.</li>
			<li>Trocknen Sie die DRG-Probe, indem Sie sie auf eine trockene Petrischale legen (Abbildung 2A) und zwei- oder dreimal mit einer trockenen Pinzette von einer Stelle zur anderen bewegen (Abbildung 2B).</li>
			<li>Trocknen Sie die Pinzette mit fusselfreiem Gewebe ab, bevor Sie eine weitere DRG-Probe bewegen (Abbildung 2C).</li>
		</ol></li>
		<li>Den trockenen DRG auf das Basis-OCT geben.<ol><li>Legen Sie das trockene DRG mit einer trockenen Pinzette auf das Basis-OCT an der 12-Uhr-Position (Abbildung 1D).</li>
			<li>Halten Sie mindestens 5 mm zwischen der Oberkante des DRG und der Oberkante des Basis-OCT.</li>
			<li>Legen Sie den dorsalen Teil des DRG auf die 12-Uhr-Position und den ventralen Teil auf die 6-Uhr-Position (Abbildung 1D).</li>
		</ol></li>
		<li>Betten Sie das DRG-Gewebe mit OCT ein.<ol><li>Fügen Sie weitere OCT hinzu, um die gesamte DRG-Probe in runder oder ovaler Form mit dem DRG in der Mitte abzudecken (Abbildung 1E).</li>
			<li>Achten Sie darauf, dass die Oberkante des OAT die DRG am oberen Rand des Basis-OAT bedeckt (Abbildung 1F), da dies die Übertragung des Schnitts auf den Objektträger erleichtert (Abbildung 3A). HINWEIS: Wenn sich das Deckel-OCT in der Mitte des Basis-OCT befindet, blockiert die Oberkante des Basis-OCT den Glasobjektträger, um den Abschnitt aufzufangen (Abbildung 3B).</li>
			<li>Die OCT- und DRG-Probe für weitere 5 Minuten bei -20 °C einfrieren (Abbildung 1G). Trimmen Sie das OAT nicht um die DRG-Probe herum.</li>
			<li>Schneiden Sie die Oberseite der Abdeckung OCT mit einer Dicke von 30 μm ab, bis das DRG sichtbar ist.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Kryosektion des DRG
<ol><li>Ändern Sie die Dicke des Kryostatabschnitts auf 12 μm, um DRG-Abschnitte auf den Objektträger zu schneiden (Abbildung 1H).</li>
	<li>Halten Sie den OCT-Abschnitt mit einem kleinen Pinsel, der auf -20 °C abgekühlt ist, an der Unterseite. HINWEIS: Es ist wichtig, nicht den gesamten Abschnitt vollständig abzuschneiden, sondern 1-3 mm ungeschnitten zu lassen (Abbildung 1I).</li>
	<li>Berühren Sie mit dem Ende einer Pinzette bei Raumtemperatur vorsichtig die Unterseite (Sechs-Uhr-Position) des Abschnitts, damit er an der Oberfläche der Plattform haftet (Abbildung 1J). Dadurch wird verhindert, dass sich der Abschnitt in einer Rolle nach hinten krümmt, was das Auffangen des Abschnitts auf dem Schlitten erschwert. HINWEIS: Wenn die Unterseite des Abschnitts an der Oberfläche der Plattform klebt und die Oberseite des Abschnitts noch mit dem Deckel-OCT verbunden ist, hat der Abschnitt eine flache Form (Abbildung 1K), was das Sammeln des Abschnitts auf der Rutsche erheblich erleichtert.</li>
	<li>Nehmen Sie einen Objektträger aus geladenem Glas (siehe Materialtabelle) und legen Sie den Objektträger langsam über den Abschnitt. Sobald der Abschnitt anfängt, am Schlitten zu kleben, ziehen Sie den Schlitten vorsichtig nach hinten (Abbildung 1L).</li>
	<li>Führen Sie den gleichen Vorgang aus, um mehr DRG-Abschnitte auf die Folie zu bringen, ohne die Abschnitte zu überlappen (Abbildung 1M). Stellen Sie sicher, dass ein neuer DRG-Abschnitt nicht über dem OCT eines anderen DRG-Abschnitts platziert wird (Abbildung 4), da ein solcher Abschnitt nicht gut auf dem Objektträger bleiben kann und während des immunchemischen Färbeprozesses weggespült werden kann.</li>
</ol>3. Nissl-Färbung des DRG-Abschnitts auf dem Objektträger
<ol><li>Waschen Sie die Abschnitte 10 Minuten lang in PBS plus 0,1 % Triton X-10. Waschen Sie die Abschnitte dann zweimal mit PBS.</li>
	<li>Tragen Sie eine Nissl-Färbung im Maßstab 1:300 (siehe Materialtabelle) auf den Objektträger auf und inkubieren Sie ihn 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie den Abschnitt mit PBS plus 0,1 % Triton X-100. Waschen Sie die Abschnitte dann zweimal 5 Minuten lang mit PBS und dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Tragen Sie 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Fluoromount-G auf (siehe Materialtabelle), um die Abschnitte mit einem Deckglas abzudecken.</li>
</ol>

Kryosektion des Spinalwurzelganglion der Maus

<ol>
	<li>Guan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injured+sensory+neuron-derived+CSF1+induces+microglial+proliferation+and+DAP12-dependent+pain.">Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+root+ganglion+macrophages+contribute+to+both+the+initiation+and+persistence+of+neuropathic+pain.">Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain.</a> Nature Communications. 11 (1), 264 (2020).</li><li>Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+its+role+in+pain.">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).</li><li>Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+of+dorsal+root+ganglion+neurons:+study+of+oxytocin+expression.">Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression.</a> Molecular Brain. 15 (1), 44 (2022).</li><li>Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuro-immune+interactions+in+chronic+pain:+implications+for+clinical+practice.">The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice.</a> Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).</li><li>Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+characteristics+of+the+dorsal+root+ganglion+as+a+target+for+neuromodulation.">Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation.</a> Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).</li><li>Chen, X. J., Sun, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+circuit+mechanisms+of+itch.">Central circuit mechanisms of itch.</a> Nature Communications. 11 (1), 3052 (2020).</li><li>Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+views+on+inflammatory+pain+mechanisms:+TRPing+over+innate+and+microglial+pathways.">Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways.</a> F1000Research. , (2016).</li><li>Boadas-Vaello, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroplasticity+of+ascending+and+descending+pathways+after+somatosensory+system+injury:+reviewing+knowledge+to+identify+neuropathic+pain+therapeutic+targets.">Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets.</a> Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).</li><li>Guha, D., Shamji, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+root+ganglion+in+the+pathogenesis+of+chronic+neuropathic+pain.">The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain.</a> Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).</li><li>Shorrock, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UBA1/GARS-dependent+pathways+drive+sensory-motor+connectivity+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy.</a> Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).</li><li>Sleigh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trk+receptor+signaling+and+sensory+neuron+fate+are+perturbed+in+human+neuropathy+caused+by+Gars+mutations.">Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).</li><li>Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+somatosensory+neuron+involvement+in+the+SOD1(G93A)+mouse+model.">Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model.</a> Scientific Reports. 12 (1), 7600 (2022).</li><li>Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+for+rapid+dissection+of+mouse+dorsal+root+ganglia+from+defined+spinal+levels.">A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels.</a> BMC Research Notes. 13 (1), 302 (2020).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release.">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).</li><li>Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+dorsal+root+ganglion+neuron+cell+lines.">Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184 (2020).</li><li>Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+transcriptional+signatures+of+neuropathic+pain.">Common transcriptional signatures of neuropathic pain.</a> Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).</li><li>Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+changes+in+dorsal+root+ganglia+following+peripheral+nerve+injury:+roles+in+inflammation,+cell+death+and+nociception.">Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception.</a> Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).</li><li>Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+and+chemokine+regulation+of+sensory+neuron+function.">Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+outgrowth,+neuropeptides+expression+and+receptors+tyrosine+kinase+phosphorylation+in+3D+organotypic+cultures+of+adult+dorsal+root+ganglia.">Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia.</a> PLoS One. 12 (7), e0181612 (2017).</li><li>Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+nature+of+dorsal+root+ganglion+neurons:+Linking+structure+with+polarity+and+function.">The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function.</a> Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).</li><li>Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+sensory+afferent+compartments+in+health+and+disease.">The structure of sensory afferent compartments in health and disease.</a> Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).</li><li>Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+transcriptomic+analysis+of+human+dorsal+root+ganglion+neurons.">Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons.</a> eLife. 10, e71752 (2021).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Hunt, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRGquant:+A+new+modular+AI-based+pipeline+for+3D+analysis+of+the+DRG.">DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG.</a> Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497 (2022).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll bietet ein einfaches Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Kryostat-Sektion des Maus-DRG, um zuverlässig qualitativ hochwertige DRG-Schnitte auf Objektträgern zu erhalten. Dieses Protokoll besteht aus vier kritischen Schritten. Zuerst müssen die DRG-Probe und die Pinzette trocken sein, bevor die DRG-Probe auf das Basis-OCT gelegt wird. Jede Flüssigkeit, die die DRG-Probe umgibt, bildet eine Eishülle um sie herum, was dazu führt, dass sich DRG-Abschnitte vom OCT lösen und nach oben krümmen. Zwei...

Das Spinalganglion (DRG) enthält die primären sensorischen Neuronen, die Gewebemakrophagen und die Satellitenzellen, die die primären sensorischen Neuronen umgeben 1,2,3,4. Es ist eine wichtige anatomische Struktur bei der Verarbeitung harmloser und schädlicher Signale und spielt eine entscheidende Rolle bei Schmerzen, Juckreiz und verschiedenen peripheren Nervenerkrankungen 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Obwohl mehrere Methoden entwickelt wurden, um DRG-Gewebe aus dem Rückenmark der Maus zu präparieren14,15,16, bleibt die Kryosektion des DRG-Gewebes eine Herausforderung, da das DRG-Gewebe recht klein ist und Kryostatschnitte von DRG-Proben dazu neigen, sich zu Rollen zu krümmen, was es schwierig macht, die Kryostatabschnitte richtig auf Glasobjektträger zu übertragen. Die richtige Kryosektion des DRG-Gewebes ist jedoch entscheidend für immunhistochemische Untersuchungen und die Struktur der DRG-sensorischen Neuronen 17,18,19,20,21,22,23. Da die Ergebnisse der Einzelzell-RNA-Sequenzierung die bemerkenswerte Heterogenität der DRG-sensorischen Neuronen sowohl bei Menschen24 als auch bei Mäusen25 gezeigt haben, ist die richtige Kryosektion von DRG-Gewebe entscheidend für die Untersuchung der funktionellen Rolle verschiedener DRG-Zellen unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen.
Obwohl die Tissue-Clearing-Technik angewendet wurde, um die 3D-Rekonstruktion des DRG26 als alternative Technik der Kryosektion des DRG zu untersuchen, ist die Tissue-Clearing-Technik zeit- und arbeitsaufwändig. Im Vergleich dazu ist die Kryosektion des DRG schnell und relativ einfach durchzuführen und bleibt daher eine Schlüsseltechnik für Immunhistochemie und Strukturstudien des DRG und anderer Regionen des zentralen Nervensystems. Die Gewinnung qualitativ hochwertiger, intakter und flacher Kryostatschnitte auf Glasobjektträgern bleibt jedoch eine Herausforderung in der neurowissenschaftlichen Forschung, da die Probengröße von Geweben, wie dem DRG und bestimmten Hirnregionen, winzig ist, und es gibt derzeit keinen Artikel, der das optimale Protokoll für die Kryosektion kleiner Gewebeproben, wie z. B. Maus-DRGs, beschreibt.
Dieses Protokoll bietet eine einfache, Schritt-für-Schritt-Technik für die Kryostat-Sektion des Maus-DRG, um zuverlässig so viele hochwertige DRG-Schnitte auf den Objektträgern für nachfolgende DRG-Studien zu erhalten. Obwohl diese Technik speziell für die Kryosektion von DRG-Proben entwickelt wurde, kann sie möglicherweise auch für die Kryosektion verschiedener anderer Gewebe mit einer kleinen Probengröße verwendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Avertin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T48402-25G</td>
			<td>Anesthetize animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia&#160;Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1910</td>
			<td>Hold the OCT section at the bottom&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergo Tweezers</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S95310</td>
			<td>Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o&#8217;clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td>To collect the DRG section&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pens</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>133794</td>
			<td>&#160;Mark the orientation of base OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scigen&#160;Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>&#160;23730571</td>
			<td>Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a procedure for mouse dorsal root ganglion cryosectioning

Qualitativ hochwertige Kryostatschnitte des Spinalganglions (DRG) der Maus sind entscheidend für eine ordnungsgemäße immunchemische Färbung und RNAscope-Studien bei der Erforschung von entzündlichen und neuropathischen Schmerzen, Juckreiz sowie anderen peripheren neurologischen Erkrankungen. Aufgrund der winzigen Probengröße des DRG-Gewebes bleibt es jedoch eine Herausforderung, konsistent qualitativ hochwertige, intakte und flache Kryostatschnitte auf Glasobjektträgern zu erhalten. Bisher gibt es keinen Artikel, der ein optimales Protokoll für die DRG-Kryosektion beschreibt. Dieses Protokoll stellt eine Schritt-für-Schritt-Methode dar, um die häufig auftretenden Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der DRG-Kryosektion zu lösen. Der vorgestellte Artikel erklärt, wie man die umgebende Flüssigkeit aus den DRG-Gewebeproben entfernt, die DRG-Schnitte auf dem Objektträger mit der gleichen Ausrichtung platziert und die Abschnitte auf dem Glasobjektträger abflacht, ohne sich nach oben zu krümmen. Obwohl dieses Protokoll für die Kryosektion der DRG-Proben entwickelt wurde, kann es auch für die Kryosektion vieler anderer Gewebe mit einer kleinen Probengröße angewendet werden.

The dorsal root ganglion (DRG) contains the primary sensory neurons, the tissue macrophages, and the satellite cells that surround the primary sensory neurons1,2,3,4. It is a key anatomic structure in processing innocuous and noxious signals, and plays critical roles in pain, itch, and various peripheral nerve disorders5,6,7,8,9,10,11,12,13. Although several methods have been developed to dissect DRG tissue from the mouse spinal cord14,15,16, cryosectioning of the DRG tissue remains challenging as the DRG tissue is quite small, and cryostat sections of DRG samples tend to curve into rolls, making it difficult to properly transfer the cryostat sections onto glass slides. However, proper cryosectioning of the DRG tissue is crucial for immunohistochemistry studies and the structure of DRG sensory neurons17,18,19,20,21,22,23. Moreover, as single-cell RNA sequencing results have revealed the remarkable heterogeneity of DRG sensory neurons in both humans24 and mice25, proper cryosectioning of DRG tissue is critical for investigating the functional role of different DRG cells in various physiological and pathological conditions.
Although the tissue-clearing technique has been applied to investigate the 3D reconstruction of the DRG26 as an alternative technique of cryosectioning the DRG, the tissue-clearing technique is time- and labor-consuming. In comparison, cryosectioning of the DRG is quick and relatively easy to perform, and thus it remains to be a key technique for immunohistochemistry and structure studies of the DRG and other regions of the central nervous system. However, obtaining high-quality, intact, and flat cryostat sections onto glass slides remains to be a challenge in neuroscience research because of the tiny sample size of tissues, like the DRG and certain brain regions, and there is no article describing the optimal protocol at this point for cryosectioning small-sized tissue samples, such as mouse DRGs.
This protocol provides an easy, step-by-step technique for cryostat sectioning of the mouse DRG to reliably obtain as many high-quality DRG sections on the slides for subsequent DRG studies. While specifically designed for cryosectioning DRG samples, this technique can potentially be used for cryosectioning various other tissues with a small sample size.

Autor im Rampenlicht: Ein Verfahren zur Kryosektion des Spinalganglion der Maus  

Ein Verfahren zur Kryosektion von Spinalganglien der Maus

It remains a challenge to consistently obtain high-quality, intact, and flat mouse dorsal root ganglion cryostat sections. The research aims to answer how to acquire ideal mouse dorsal root ganglion cryostat section. This protocol provides an easy step-by-step technique for cryostat section of the mouse DRG to high quality, intact, and flat mouse DRG cryostat sections.This presented article explains how to remove surrounding liquid from the mouse DRG sample tissue, placing the DRG sections on the slides facing the same orientation, and flatten the DRG sections without curving up. One major challenge is that the OCT sections of mouse DRG tend to curve into a roll, making it difficult to place onto the glass slide. It is also challenging to acquire sufficient sections from one sample due to the small size of the mouse DRG.

In der aktuellen Studie wurden etwa 16 kontinuierliche, qualitativ hochwertige DRG-Schnitte von einem L4-DRG der Maus gesammelt. Die erhaltenen Schnitte waren ohne jegliche Verzerrung. Abbildung 1 zeigt die Schritt-für-Schritt-Vorgehensweise für die Kryoschnittung. Die Entfernung von überschüssiger Flüssigkeit aus den Gewebeschnitten ist in Abbildung 2 dargestellt. Der Prozess der OCT-Einbettung des Gewebes ist in Abbildung 3 d...

Watch this Scientific Journal Video about A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning at JoVE.com

Vorgestellt wird die Entwicklung zur konsequent hochwertigen Erfassung von Kryostatschnitten der Spinalganglien.

High-quality mouse dorsal root ganglion (DRG) cryostat sections are crucial for proper immunochemistry staining and RNAscope studies in the research of ...

Es ist nach wie vor eine Herausforderung, konsistent qualitativ hochwertige, intakte und flache Kryostatschnitte der Spinalganglionen der Maus zu erhalten. Die Forschung zielt darauf ab, die Frage zu beantworten, wie ein idealer Kryostatschnitt des Spinalganglions der Maus erhalten werden kann. Dieses Protokoll bietet eine einfache Schritt-für-Schritt-Technik für Kryostatschnitte des Maus-DRG bis hin zu hochwertigen, intakten und flachen Maus-DRG-Kryostatabschnitten.In diesem Artikel wird erläutert, wie die umgebende Flüssigkeit aus dem DRG-Probengewebe der Maus entfernt wird, indem die DRG-Abschnitte auf den Objektträgern mit der gleichen Ausrichtung platziert und die DRG-Abschnitte abgeflacht werden, ohne sich nach oben zu krümmen. Eine große Herausforderung besteht darin, dass die OCT-Abschnitte des Maus-DRG dazu neigen, sich zu einer Rolle zu krümmen, was das Platzieren auf dem Objektträger erschwert. Aufgrund der geringen Größe des Maus-DRG ist es auch schwierig, genügend Schnitte aus einer Probe zu gewinnen.

a-procedure-for-mouse-dorsal-root-ganglion-cryosectioning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning

3.9K Aufrufe.  Capital Medical University. Es ist nach wie vor eine Herausforderung, konsistent qualitativ hochwertige, intakte und flache Kryostatschnitte der Spinalganglionen der Maus zu erhalten. Die Forschung zielt darauf ab, die Frage zu beantworten, wie ein idealer Kryostatschnitt des Spinalganglions der Maus erhalten werden kann. Dieses Protokoll bietet eine einfache Schritt-für-Schritt-Technik für Kryostatschnitte des Maus-DRG bis hin zu hochwertigen, intakten und flachen Maus-DRG-Kryostatabschnitten.In diesem Artikel...