هذه الدراسة مدعومة من قبل مؤسسة أبحاث الجلوكوما شافير جرانت ، وجائزة 4-CA Cavalier التعاونية ، R01EY029121 ، R01EY035088 ، ومؤسسة Knights Templar Eye.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في جامعة فيرجينيا وتتوافق مع المبدأ التوجيهي بشأن استخدام من المعهد الوطني للصحة (NIH). راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. في الجسم الحي مقابل التصوير OCT
<ol><li>نظام OCT<ol><li>تخيل عيون الفئران باستخدام نظام OCT لحيوان صغير يستخدم مصدر ضوء فائق الاستمرارية ، والذي يوفر إضاءة الضوء المرئي بين 480 نانومتر و 650 نانومتر. تأكد من أن الطاقة الساقطة على القرنية هي 1 ميغاواط واستخدم معدل خط A يبلغ 25 كيلو هرتز وزمن تكامل يبلغ 39.3 ميكروثانية لكل خط A.</li>
		<li>تأكد من أن نطاق الكشف الطيفي لمقياس الطيف يتراوح بين 508 نانومتر و 613 نانومتر ، مما يوفر دقة محورية تبلغ 1.3 ميكرومتر في شبكية العين. يبلغ إجمالي حجم التصوير حوالي 700 ميكرومتر (x) × 700 ميكرومتر (y) × 1500 ميكرومتر (z). تتراوح الدقة الجانبية بين 4.5 ميكرومتر في مركز مجال الرؤية و 8.7 ميكرومتر عند 350 ميكرومتر من المركز11,13.</li>
	</ol></li>
	<li>تخدير الفأر<ol><li>تخدير الفئران من خلفية C57BL / 6 وممارسة الجنس مع حقن داخل الصفاق من الكيتامين (114 ملغم / كغم) وكوكتيل زيلازين (17 ملغ / كغ) وتوسيع حدقة العين باستخدام قطرات تروبيكاميد 1٪. تأكد من التخدير الكافي عن طريق فقدان منعكس الدواسة بعد قرصة إصبع القدم الثابت.</li>
		<li>أثناء التصوير ، حافظ على دفء الماوس باستخدام مصباح حرارة الأشعة تحت الحمراء. بعد كل صورة ، ضع الدموع الاصطناعية لمنع جفاف القرنية.</li>
	</ol></li>
	<li>وضع الماوس للتصوير<ol><li>ضع الماوس المخدر على حامل واحتفظ بالماوس في موضعه بمساعدة شريطين فيلكرو. ملاحظة: يسمح حامل بالحركة في ثلاثة أبعاد (الضبط الرأسي ، الضبط الأفقي الدقيق ، بالإضافة إلى تعديلات الميل والانحراف) لوضع الليزر في عين الماوس.</li>
	</ol></li>
	<li>ضبط معلمات التصوير<ol><li>قم بتشغيل الكمبيوتر وافتح البرنامج المشار إليه ، والذي سيقوم بتشغيل الليزر تلقائيا.</li>
		<li>اضبط حامل حتى يستقر الليزر ويتمركز في عين الماوس. تصور الجزء الخلفي من العين من خلال معاينة En Face في واجهة البرنامج ، ومجال الرؤية (FOV) للضفيرة الوعائية السطحية ، و B-scan، المقطع العرضي للشبكية داخل مجال الرؤية.</li>
		<li>احصل على وحدة تخزين مقابل OCT بالنقر فوق الزر "اكتساب " على واجهة البرنامج بعد إجراء تعديلات طفيفة على التركيز البصري ، والذي يتكون من 512 خطا A / B-scan و 512 B-scans / volume. ملاحظة: تستغرق هذه العملية ~ 10.5 ثانية. يتم توجيه الحصول على الصور بواسطة مقدر مؤشر جودة مدمج (QI) لضمان عدم تضمين الصور التي تقل عن عتبة محددة مسبقا (QI < 45).<ol><li>لكل ماوس ، احصل على أربعة مجلدات مقابل OCT من نفس العين. قم بمحاذاة رأس العصب البصري (ONH) في كل زاوية من الزوايا الأربع في مجال الرؤية لتغطية مناطق مختلفة من شبكية العين. ملاحظة: يقلل هذا التنسيب من انحناء الشبكية ، مما يزيد من انعكاس RNFL في جميع أنحاء مجال الرؤية. يتطلب ~ 1 دقيقة لإعادة وضع العين بين كل عملية اكتساب (الشكل 1 أ ، ب).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>تحليل OCTF ملاحظة: يستخدم MATLAB لإجراء تحليل الصور.<ol><li>لتوليد ألياف vis-OCT من حجم vis-OCT ، استخدم طريقة عتبة قائمة على الشدة (خط رمز MATLAB 808) للكشف عن سطح شبكية العين. ملاحظة: تستخدم هذه الخطوط وظيفة imadjust لضبط قيم شدة bscan. تحدد الوسيطة [0.0087 0.08] التي تم تمريرها للضبط نطاق الشدة المراد تعيينه إلى النطاق الديناميكي الكامل لصورة المخرجات.</li>
		<li>قم بقص RNFL عن طريق تحديد أول ~ 16 ميكرومتر في العمق. انظر سطر كود Matlab 782. ملاحظة: سمك RNFL النموذجي في الجسم الحي في ماوس C57BL / 6 من النوع البري البالغ هو ~ 14 ميكرومتر ويمكن أن يختلف بين طرق التجزئة المختلفة13.</li>
		<li>قم بتغيير مسارات ملف RAW (السطر 9) وملفات إعادة الإعمار (السطر 11) واسم الملف (السطر 15) وانقر فوق تشغيل وانتظر حتى يتم تحليل صورة OCT بواسطة كود MATLAB. احسب متوسط الإسقاط على طول الاتجاه المحوري (z) (خطوط كود MATLAB 905-908) لإنشاء صورة مخطط الألياف المكونة من حزم محور عصبي RGC والأوعية الدموية المحيطة. قم بمونتاج الصور الأربع بعد معالجة الألياف لكل مجال رؤية عن طريق محاذاة الأوعية الدموية مع محرر رسومات من اختيارك ، يغطي ~ 1.2 × 1.2 مم في المجموع. عادة ما يتم حفظ ملفات RAW في المجلد: Halo Data ، تحت تاريخ تصوير OCT (على سبيل المثال ، 0606 Opticent). ملاحظة: رموز MATLAB متوفرة في الملف التكميلي 1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. التصوير البؤري خارج الجسم الحي
<ol><li>القتل الرحيم للفأر<ol><li>بعد الحصول على بيانات OCT ، القتل الرحيم للفئران بمزيج من صوديوم بنتوباربيتال (390 مجم / مل) وصوديوم الفينيتوين (50 مجم / مل). يعمل الصوديوم الفينيتوين عن طريق تضخيم آثار الصوديوم بنتوباربيتال ، والذي تم تطبيقه على نطاق واسع في القتل الرحيم للقوارض14،15. لكل فأر ، استخدم 0.2 مل / 20 جم من الخليط المخفف (156 مجم / مل) وبيرفيوز مع 20 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثم 20 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS16,17.</li>
	</ol></li>
	<li>تشريح العين وتوجيهها<ol><li>قم باستئصال العينين ووضع علامة على الجانب الزمني للإشارة إلى الاتجاه.</li>
		<li>بعد إزالة الغرفة الأمامية بعناية ، عدسة العين ، الجسم الزجاجي ، وإصلاح أكواب العين في PFA لمدة 30 دقيقة.</li>
		<li>اغسل أكواب العين باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة ، واستبدل محلول PBS 3x أثناء الغسيل. ثم اغسل باستخدام 0.5٪ Triton X-100 في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.5) لمدة 30 دقيقة.</li>
		<li>احتضان أكواب العين في حاجز مانع (5٪ مصل حمار مع 2.5٪ ألبومين مصل بقري و 0.5٪ Triton X-100 في محلول ملحي مخزن تريس [درجة الحموضة 7.5]) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.</li>
	</ol></li>
	<li>تلطيخ مناعي ملاحظة: أكواب العين جاهزة الآن للتلطيخ بالأجسام المضادة الأولية للفأر المضاد ل Tuj1 للكشف عن حزم محور عصبي RGC والفئران المضادة ICAM-2 للكشف عن الأوعية الدموية.<ol><li>احتضان أكواب العين طوال الليل بالأجسام المضادة الأولية ، مضاد Tuj1 للفأر (1: 200 في المخزن المؤقت للحجب) والفئران المضادة ل ICAM-2 (1: 500 في العازلة للحجب) ، عند 4 درجات مئوية.</li>
		<li>اغسل أكواب العين 3-5x لمدة 1 ساعة في كل مرة ، بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات يحتوي على 0.5٪ Triton X-100 (PBST) لتقليل الخلفية وإزالة أي جسم مضاد غير مرتبط.</li>
		<li>بعد الغسيل ، احتضن أكواب العين طوال الليل بالأجسام المضادة الثانوية ، والغلوبولين المناعي G المضاد للحمار المضاد للفأر المترافق مع صبغة Alexa Fluor 488 (مضان أخضر) ومضاد للحمار IgG مترافق مع صبغة Alexa Fluor 594 (مضان أحمر) ، وكلها مخففة 1: 1000 في حاجز مانع ، عند 4 درجات مئوية.</li>
		<li>في اليوم التالي ، اغسل أكواب العين 3-5x لمدة 1 ساعة لكل منها باستخدام PBST لتقليل الخلفية وإزالة الأجسام المضادة غير المنضمة.</li>
		<li>انقل أكواب العين إلى طبق بتري من برنامج تلفزيوني قبل التثبيت المسطح.</li>
	</ol></li>
	<li>شبكية مسطحة مثبتة<ol><li>بعد عملية التلوين المناعي ، اعزل شبكية العين عن أكواب العين تحت المجهر.</li>
		<li>قطع شبكية العين إلى أربع أوراق وتثبيتها بشكل مسطح مع توجيه طبقة RGC لأعلى. اترك العلامة على الجانب الصدغي متصلة بالشبكية للإشارة إلى الاتجاه.</li>
		<li>تغطية شبكية العين مع تصاعد المتوسطة13,18. ختم الشرائح بطلاء الأظافر13،18،19.</li>
	</ol></li>
	<li>التصوير البؤري ملاحظة: تم إجراء معالجة الصور للصور متحدة البؤر باستخدام برنامج ZEN المجهري.<ol><li>قم بتشغيل المجهر متحد البؤر ، وضمن وضع تحديد الموقع ، ابحث عن منطقة الاهتمام باستخدام عدسة المجهر.</li>
		<li>ضمن وضع الاكتساب ، قم بإعداد مربعات لتغطية شبكية العين بالكامل وشرائح z-stack لتغطية جميع طبقات المعلومات. قم بتصوير 25 بلاطة على الأقل عبر شبكية العين بأكملها لتغطية الحجم الإجمالي البالغ 5.99 مم (x) × 5.88 مم (y) × 30 μm (z) بحجم بكسل يبلغ 1.24 ميكرومتر / بكسل.</li>
		<li>اعرض شرائح Z-stack لإنشاء صور مجهرية متحدة البؤر ثنائية الأبعاد (الشكل 1C ، D) 11،13،19،20،21.</li>
	</ol></li>
</ol>3. محاذاة الصور داخل الجسم الحي وخارج الجسم الحي
<ol><li>بعد معالجة مخطط الألياف ، قم بإنشاء صورة مركبة تتضمن الصور الأربع التي تم الحصول عليها من كل ماوس عن طريق محاذاة جميع الأوعية الدموية مع محرر رسومات من اختيارك. ملاحظة: في المتوسط، تبلغ الصورة المركبة النهائية حوالي 1.2 مم (x) × 1.2 مم (y)، كما هو موضح في الشكل 1B.</li>
	<li>استخدم رأس العصب البصري (ONH) ونمط الأوعية الدموية كمعالم لمحاذاة مخطط الألياف المركب. احصل على المحاذاة داخل الجسم الحي وخارج الجسم الحي عن طريق تداخل نمط الأوعية الدموية لصور OCT المركبة مع الصور متحدة البؤر لنفس شبكية العين الملطخة ب ICAM-2.</li>
</ol>

محاذاة الألياف الشبكية OCT الماوس مع الصور البؤرية

<ol>
	<li>Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+retinal+ganglion+cell+structure+and+function.">Development of retinal ganglion cell structure and function.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).</li><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+types+of+retinal+ganglion+cells:+current+status+and+implications+for+neuronal+classification.">The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li><li>Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture,+function,+and+assembly+of+the+mouse+visual+system.">Architecture, function, and assembly of the mouse visual system.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).</li><li>Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+function,+organization,+and+development+of+the+mouse+superior+colliculus.">Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus.</a> Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).</li><li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+glaucomatous+optic+neuropathy:+the+synergy+between+clinical+observation+and+investigation.">Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation.</a> Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).</li><li>Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glaucoma:+thinking+in+new+ways-a+role+for+autonomous+axonal+self-destruction+and+other+compartmentalised+processes.">Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).</li><li>Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+injury+signaling+and+compartmentalized+injury+response+in+glaucoma.">Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).</li><li>Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-dependent+morphological+and+functional+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+mouse+models+of+experimental+glaucoma.">Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma.</a> Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).</li><li>Tatham, A. J., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+structural+progression+in+glaucoma+with+optical+coherence+tomography.">Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography.</a> Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).</li><li>Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible-light+optical+coherence+tomography:+a+review.">Visible-light optical coherence tomography: a review.</a> Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).</li><li>Miller, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy+for+quantitative+imaging+of+retinal+ganglion+cell+axon+bundles.">Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).</li><li>Beckmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+inner+retinal+layer+structure+in+mice+after+eye-opening+using+visible-light+optical+coherence+tomography.">In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography.</a> Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).</li><li>Grannonico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+damages+in+retinal+ganglion+cell+axon+bundles+monitored+non-invasively+by+visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy.">Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy.</a> Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).</li><li>Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+Injection+of+Ethanol+for+the+Euthanasia+of+Laboratory+Mice+(Mus+musculus)+and+Rats+(Rattus+norvegicus).">Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).</li><li>Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologic,+Behavioral,+and+Histologic+Responses+to+Various+Euthanasia+Methods+in+C57BL/6NTac+Male+Mice.">Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+degeneration+of+retinal+and+superior+collicular+functions+in+mice+with+sustained+ocular+hypertension.">Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).</li><li>Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+laser-induced+mouse+model+of+chronic+ocular+hypertension+to+characterize+visual+defects.">A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+experimental+glaucoma+on+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+in+mice.">Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice.</a> Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).</li><li>Thomson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-1+knockout+mice+as+a+genetic+model+of+open-angle+glaucoma.">Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).</li><li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+ocular+hypertension+induces+dendritic+degeneration+of+mouse+retinal+ganglion+cells+that+depends+on+cell+type+and+location.">Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).</li><li>Grannonico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+analysis+of+retinal+ganglion+cell+damage+at+individual+axon+bundle+level+in+mice+using+visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy.">Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy.</a> Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).</li></ol>

تشانغ ، س. ، لا شيء ؛ شو ، دبليو ، لا شيء ؛ مروحة ، دبليو ، لا شيء ؛ ماكدانيال ، ج. أ. ، لا شيء ؛ د. أ. ميلر, اي; م. جرانونيكو ، اي; م. ليو, اي; خ. ليو, اي; لدى H.F. Zhang مصالح مالية في Opticent Health ، والتي لم تدعم هذا العمل.

هناك خطوتان في هذا البروتوكول تتطلبان الاهتمام. أولا ، من الضروري التأكد من أن يخضع للتخدير العميق وأن عيونه متوسعة بالكامل قبل التصوير المقطعي المحوسب. إذا لم يتم تخدير الفئران بشكل كاف ، فقد يؤدي تنفسها السريع إلى حركات غير مستقرة لصور الوجه ، مما قد يؤثر سلبا على جودة الألياف. علاو?...

تلعب خلايا العقدة الشبكية (RGCs) دورا مهما في معالجة المعلومات المرئية ، حيث تتلقى مدخلات متشابكة من خلال أشجارها المتغصنة في الطبقة الضفيرية الداخلية (IPL) وتنقل المعلومات عبر محاورها في طبقة الألياف العصبية الشبكية (RNFL) إلى الدماغ1،2،3،4. في الحالات المريضة مثل الجلوكوما ، قد يؤدي تنكس RGC المبكر إلى تغييرات طفيفة في RNFL ، وطبقة الخلايا العقدية (GCL) ، و IPL ، والعصب البصري في كل من المرضى ونماذج القوارض5،6،7،8،9. وبالتالي فإن الكشف المبكر عن هذه التغيرات المورفولوجية في RGCs أمر ضروري للتدخل في الوقت المناسب لمنع RGC وفقدان البصر.
لقد طورنا مؤخرا تقنية تصوير جديدة جاهزة سريريا تسمى التصوير المقطعي للتماسك البصري للضوء المرئي (vis-OCT) لتلبية الحاجة إلى المراقبة في الجسم الحي لتلف RGC. قام Vis-OCT بتحسين الدقة المحورية ، حيث وصل إلى 1.3 ميكرومتر في شبكية العين10,11 ، مما يسمح بتصور حزم محور RGC الفردية في RNFL. بعد ذلك ، تم إنشاء الألياف vis-OCT (vis-OCTF) لتتبع وقياس تلف RGC على مستوى حزمة محور عصبي واحد في الفئران11،12،13. ومع ذلك ، غالبا ما يكون التصوير متحد البؤر خارج الجسم الحي لشبكية العين مثل المعيار الذهبي ضروريا للتحقق من صحة النتائج في الجسم الحي. لذلك ، ستوضح هذه الدراسة كيفية محاذاة الصور في الجسم الحي التي تم الحصول عليها بواسطة vis-OCTF مع الصور متحدة البؤر خارج الجسم الحي لشبكية العين لنفس الفأر. يهدف البروتوكول إلى التحقق من صحة النتائج في الجسم الحي عن طريق التصوير خارج الجسم الحي متحد البؤر وإنشاء أساس لفحص التغيرات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء تلف RGC في الحالات المرضية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo 100</td>
			<td>Opticent Health, Evanston, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs and antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Santz Cruz Biotechnology, SC-281692</td>
			<td></td>
			<td>1-2 drops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin powder</td>
			<td>Fisher Scientific, BP9706-100</td>
			<td></td>
			<td>1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202</td>
			<td></td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209</td>
			<td></td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))</td>
			<td>Covetrus, NDC 11695-4860-1</td>
			<td></td>
			<td>15.6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Covetrus, NADA043304</td>
			<td></td>
			<td>114 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Tuj1</td>
			<td>A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia</td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum(NDS)</td>
			<td>Millipore Sigma, S30-100 mL</td>
			<td></td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 
			(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3</td>
			<td></td>
			<td>1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-ICAM-2</td>
			<td>BD Pharmingen, Cat#553325</td>
			<td></td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide drops&#160;</td>
			<td>Covetrus, NDC17478-102-12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 
			(Reagent Grade)</td>
			<td>VWR, CAS: 9002-93-1</td>
			<td></td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories Inc. H2000-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Covetrus, NDC59399-110-20</td>
			<td></td>
			<td>17 mg/kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alignment of visible-light optical coherence tomography fibergrams with confocal images of the same mouse retina

في السنوات الأخيرة ، تم تطبيق تصوير الشبكية في الجسم الحي ، والذي يوفر معلومات غير جراحية وفي الوقت الفعلي وطولية حول الأنظمة والعمليات البيولوجية ، بشكل متزايد للحصول على تقييم موضوعي للتلف العصبي في أمراض العيون. غالبا ما يكون التصوير البؤري خارج الجسم الحي لنفس شبكية العين ضروريا للتحقق من صحة النتائج في الجسم الحي خاصة في الأبحاث على. في هذه الدراسة ، أظهرنا طريقة لمحاذاة صورة متحدة البؤر خارج الجسم الحي لشبكية العين مع صورها في الجسم الحي . تم تطبيق تقنية تصوير جديدة جاهزة سريريا تسمى الألياف المقطعية للتماسك البصري للضوء المرئي (vis-OCTF) للحصول على صور في الجسم الحي لشبكية الفأر. ثم أجرينا التصوير متحد البؤر لشبكية العين نفسها مثل "المعيار الذهبي" للتحقق من صحة الصور في الجسم الحي مقابل OCTF. لا تتيح هذه الدراسة مزيدا من التحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية فحسب ، بل تضع أيضا أساسا لتقييم حساس وموضوعي للتلف العصبي في الجسم الحي.

Retinal ganglion cells (RGCs) play a critical role in visual information processing, receiving synaptic inputs through their dendritic trees in the inner plexiform layer (IPL) and transmitting the information via their axons in the retinal nerve fiber layer (RNFL) to the brain1,2,3,4. In diseased conditions such as glaucoma, early RGC degeneration may result in subtle changes in the RNFL, the ganglion cell layer (GCL), the IPL, and the optic nerve in both patients and rodent models5,6,7,8,9. Early detection of these morphological changes in RGCs is thus essential for timely intervention to prevent RGC and vision loss.
We have recently developed a new clinical-ready imaging technology called visible-light optical coherence tomography (vis-OCT) to satisfy the need for in vivo monitoring of RGC damage. Vis-OCT improved the axial resolution, reaching 1.3 &#181;m in the retina10, 11, allowing for the visualization of individual RGC axon bundles in the RNFL. Subsequently, vis-OCT fibergraphy (vis-OCTF) was established to track and quantify RGC damage at the single axon bundle level in mice11,12,13. However, ex vivo confocal imaging of the same retina as the gold standard is often necessary to validate the in vivo findings. Therefore, this study will demonstrate how to align in vivo images acquired by vis-OCTF with ex vivo confocal images of the same mouse retina. The protocol aims to validate the in vivo findings by ex vivo confocal imaging and establish a foundation for examining the molecular and cellular changes underlying RGC damage in diseased conditions.

تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في تصوير الشبكية في الجسم الحي وخارج الجسم الحي لتحسين تشخيص وعلاج الجلوكوما 

محاذاة الألياف المقطعية للتماسك البصري للضوء المرئي مع الصور متحدة البؤر لشبكية العين للماوس نفسه

We present a protocol for aligning in vivo VIS-OCT images with ex vivo immunostained retinal nerve fibers to validate our novel imaging technology. VIS-OCT enables visualization of retinal nerve fibers in vivo, and this process confirms the accuracy of our findings. Our protocol combines in vivo and ex vivo imaging to provide a real time visualization of retina structure and confirm findings.The process is applicable to mouse models of eye diseases, provided the anterior eye portion allows for optical imaging. This includes diabetic retinopathy and retinal ischemia models. These studies lay the foundation for establishing an objective evaluation of neuro damage in humans, which can significantly improve glaucoma diagnosis and treatment in the future.

تمت مقارنة المركب مقابل الألياف OCT مع الصورة البؤرية المقابلة لشبكية العين المثبتة بشكل مسطح والمناعية مع Tuj-1 لمحاور RGC (الشكل 1D ، اللوحة العلوية). يمكن مطابقة الحزم المحورية المصورة بواسطة vis-OCTF مع الحزم المحورية التي تحمل علامة Tu-j1 على الصورة متحدة البؤر. عادة ما تظهر الأوع...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment at JoVE.com

يحدد هذا البروتوكول خطوات محاذاة صور التصوير المقطعي للتماسك البصري للضوء المرئي في الجسم الحي (vis-OCTF) مع الصور متحدة البؤر خارج الجسم الحي لشبكية العين نفسها لغرض التحقق من مورفولوجيا الحزمة المحورية لخلية العقدة العقدية المرصودة في الصور في الجسم الحي .

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

نقدم بروتوكولا لمحاذاة صور VIS-OCT في الجسم الحي مع ألياف الشبكية العصبية الملطخة بالمناعة خارج الجسم الحي للتحقق من صحة تقنية التصوير الجديدة لدينا. يتيح VIS-OCT تصور الألياف العصبية الشبكية في الجسم الحي ، وتؤكد هذه العملية دقة النتائج التي توصلنا إليها. يجمع بروتوكولنا بين التصوير في الجسم الحي وخارج الجسم الحي لتوفير تصور في الوقت الفعلي لبنية شبكية العين وتأكيد النتائج.تنطبق هذه العملية على نماذج الفئران لأمراض العيون ، بشرط أن يسمح جزء العين الأمامي بالتصوير البصري. وهذا يشمل اعتلال الشبكية السكري ونماذج نقص تروية الشبكية. تضع هذه الدراسات الأساس لإجراء تقييم موضوعي للضرر العصبي لدى البشر ، والذي يمكن أن يحسن بشكل كبير تشخيص الجلوكوما وعلاجه في المستقبل.

alignment-visible-light-optical-coherence-tomography-fibergrams-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

886 Views.  University of Virginia. نقدم بروتوكولا لمحاذاة صور VIS-OCT في الجسم الحي مع ألياف الشبكية العصبية الملطخة بالمناعة خارج الجسم الحي للتحقق من صحة تقنية التصوير الجديدة لدينا. يتيح VIS-OCT تصور الألياف العصبية الشبكية في الجسم الحي ، وتؤكد هذه العملية دقة النتائج التي توصلنا إليها. يجمع بروتوكولنا بين ال...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في تصوير الشبكية في الجسم الحي وخارج الجسم الحي لتحسين تشخيص وعلاج الجلوكوما 

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

In Vivo Visible Light Optical Coherence Tomography (OCT) Mouse Retinal Imaging

Start by positioning the anesthetized mouse on the animal holder and securing it with two Velcro straps. Turn on the computer and open the software to activate the laser. Adjust the animal holder to center the laser in the mouse's eye.Visualize the posterior part through an on-face preview, the field of view of the superficial vascular plexus, a B scan, and the retina cross-section within the field of view. Acquire a visible light optical coherence tomography, or vis-OCT volume after making minor adjustments to the optical focus. Align the optical nerve head in each of the four corners of the field of view to cover different retinal areas.Use an intensity-based threshold method to detect the retina surface, and generate vis-OCT fiber grams from the volume. Crop the retinal nerve fiber layer, or RNFL, by selecting the first 16 micrometers depth. Next, calculate the mean intensity projection along the axial direction to generate the fiber gram image composed of retinal ganglion cell axon bundles and surrounding vasculature.Align the blood vessels using a graphics editor to montage the four images post-processing. The composite vis-OCT fiber gram is compared with the corresponding confocal image of flat-mounted retina immunostained with TUJ1 for RGC axons. Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM II labeled blood vessels on the confocal image.Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-OCT revealed identical RGC exon bundle networks and surrounding retinal vasculature.

التصوير المقطعي للتماسك البصري للضوء المرئي في الجسم الحي (OCT) تصوير الشبكية للماوس

Ex Vivo Confocal Imaging of Mouse Retina

Enucleate the eyes of a euthanized mouse, marking the temporal side for orientation purposes. Remove the anterior chamber. Then remove the lens and vitreous and place eye cups in paraformaldehyde for 30 minutes.Wash eye cups with PBS for 30 minutes. Replacing the solution three times. Then, wash with 0.5%Triton X-100 for 30 minutes.Incubate eye cups in the blocking buffer for two hours at room temperature. After immunostaining, isolate the retinas from the eye cups using a microscope. Divide the retinas into four leaves and flat mount them with the retinal ganglion cell layer facing up.Ensure the mark on the temporal side remains attached for orientation. Cover the retinas with mounting medium. Place cover slips.And seal the slides using nail polish. Turn on the confocal microscope and under Locate mode, find the area of interest using the eye piece. Switch to Acquisition mode and set up tiles to cover the entire retina, along with Z-Stack slices for all layers of information.Image at least 25 tiles across the whole retina to achieve a total volume. Project the Z-Stack slices to generate two-dimensional on-face confocal microscopy images. The composite vis-OCT fibergram is compared with the corresponding confocal image of flat mounted retina immunostained with TuJ1 for RGC axons.Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM-2 labeled blood vessels on the confocal image. Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-OCT revealed identical RGC axon bundle networks and surrounding retinal vasculature.

التصوير البؤري خارج الجسم الحي لشبكية العين الفأر

Alignment of In Vivo and Ex Vivo Mouse Retinal Images

Start by creating a composite image using the four obtained images from each mouse. Utilize a graphics editor to align all the blood vessels, employ the optic nerve head and blood vessel patterns as landmarks for aligning the composite fiber gram overlap the composite images and the confocal images of the same retina stained with ICAM2, to achieve in vivo and ex vivo alignment. The composite vis-oct fiber gram is compared with the corresponding confocal image of flat mounted retina.Immuno stain with TUJ1 for RGC axons. Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM2 labeled blood vessels on the confocal image. Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-oct revealed identical RGC Axon bundle networks and surrounding retinal vasculature.