מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר DrDeramus Shaffer Grant, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088, ו Knights Templar Eye Foundation.

כל הנהלים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת וירג'יניה ותאמו את ההנחיה לשימוש בבעלי חיים מהמכון הלאומי לבריאות (NIH). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הדמיית In vivo vis-OCT
<ol><li>מערכת vis-OCT<ol><li>דמיינו את עיני העכברים באמצעות מערכת vis-OCT של חיה קטנה המשתמשת במקור אור סופר-רציף, המספק הארה באור נראה בין 480 ננומטר ל-650 ננומטר. ודא כי אירוע החשמל על הקרנית הוא 1 mW ולהשתמש בקצב קו A של 25 kHz וזמן אינטגרציה של 39.3 μs לכל קו A.</li>
		<li>ודא שטווח הגילוי הספקטרלי של הספקטרומטר הוא בין 508 ננומטר ל- 613 ננומטר, המספק רזולוציה צירית של 1.3 מיקרומטר ברשתית. נפח ההדמיה הכולל הוא בערך 700 מיקרומטר (x) x 700 מיקרומטר (y) x 1,500 מיקרומטר (z). הרזולוציה הצידית היא בין 4.5 מיקרומטר במרכז שדה הראייה ל-8.7 מיקרומטר ב-350 מיקרומטר ממרכז11,13.</li>
	</ol></li>
	<li>הרדמת עכבר<ol><li>מרדימים עכברים מרקע C57BL/6 ומקיימים יחסי מין עם זריקה תוך צפקית של קטמין (114 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (17 מ"ג/ק"ג) קוקטייל ומרחיבים את אישוניהם באמצעות טיפות טרופיקמיד 1%. ודא הרדמה נאותה על ידי אובדן רפלקס הדוושה לאחר צביטת בוהן יציבה.</li>
		<li>במהלך ההדמיה, שמור על חום העכבר באמצעות מנורת חום אינפרא אדום. לאחר כל רכישת תמונה, יש למרוח דמעות מלאכותיות למניעת התייבשות הקרנית.</li>
	</ol></li>
	<li>מיקום העכבר להדמיה<ol><li>הניחו את העכבר המרדים על בעל החיים והשאירו את העכבר במקומו בעזרת שתי רצועות סקוטש. הערה: מחזיק בעלי החיים מאפשר תנועה בתלת מימד (כוונון אנכי, כוונון אופקי עדין, כמו גם כוונון גובה ופיהוק) כדי למקם את הלייזר לעין העכבר.</li>
	</ol></li>
	<li>התאמת פרמטרי הדמיה<ol><li>הפעל את המחשב ופתח את התוכנה המוזכרת, שתפעיל את הלייזר באופן אוטומטי.</li>
		<li>כוונן את מחזיק בעל החיים עד שהלייזר יציב וממורכז לעין העכבר. דמיינו את החלק האחורי של העין באמצעות תצוגה מקדימה של En Face בממשק התוכנה, שדה הראייה (FOV) של מקלעת כלי הדם השטחית, וסריקת B, חתך הרוחב של הרשתית בתוך ה-FOV.</li>
		<li>רכוש עוצמת קול vis-OCT על ידי לחיצה על כפתור Purchase בממשק התוכנה לאחר ביצוע התאמות קלות של המיקוד האופטי, המורכב מ- 512 שורות A/B-סריקה ו- 512 סריקות B/עוצמת קול. הערה: תהליך זה אורך ~10.5 שניות. רכישת תמונות מונחית על-ידי מעריך מובנה של מדד איכות (QI) כדי להבטיח שתמונות מתחת לסף שנקבע מראש (QI < 45) לא ייכללו.<ol><li>עבור כל עכבר, רכוש ארבעה אמצעי אחסון vis-OCT מאותה עין. יישרו את ראש עצב הראייה (ONH) בכל אחת מארבע הפינות ב-FOV כדי לכסות אזורים שונים ברשתית. הערה: מיקום כזה ממזער את עקמומיות הרשתית, מה שממקסם את החזר ה- RNFL לאורך ה- FOV. נדרשת ~1 דקות כדי למקם מחדש את העין בין כל רכישה (איור 1A,B).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח Vis-OCTF הערה: MATLAB משמש לביצוע ניתוח תמונות.<ol><li>ליצירת סיבי vis-OCT מאמצעי האחסון vis-OCT, השתמשו בשיטת סף מבוססת עוצמה (שורת קוד 808 של MATLAB) כדי לזהות את פני הרשתית. הערה: קווים אלה משתמשים בפונקציה imadjust כדי להתאים את ערכי העוצמה של bscan. הארגומנט [0.0087 0.08] שהועבר לחוסר התאמה מציין את טווח העוצמות שיש למפות לטווח הדינמי המלא של תמונת הפלט.</li>
		<li>חתוך את RNFL על ידי בחירת הראשון ~ 16 מיקרומטר עומק. ראו שורת קוד 782 של Matlab. הערה: עובי ה-RNFL האופייני in vivo בעכבר C57BL/6 בוגר מסוג פרא הוא ~14 מיקרומטר ויכול להשתנות בין שיטות סגמנטציה שונות13.</li>
		<li>שנו את הנתיבים של קובץ RAW (שורה 9), קבצים לבנייה מחדש (שורה 11) ושם הקובץ (שורה 15), לחצו על ' הפעל' והמתינו לניתוח תמונת OCT באמצעות קוד MATLAB. חשב את הקרנת העוצמה הממוצעת לאורך הכיוון הצירי (z) (שורות קוד MATLAB 905-908) כדי ליצור את תמונת הפיבגרם המורכבת מצרורות אקסון RGC וכלי הדם שמסביב. מונטאז' את ארבע התמונות לאחר עיבוד סיבגרם עבור כל FOV על ידי יישור כלי הדם עם עורך גרפי לבחירה, המכסה ~ 1.2 x 1.2 מ"מ בסך הכל. קובצי RAW נשמרים בדרך כלל בתיקייה: Halo Data, תחת תאריך הדמיית OCT (לדוגמה, 0606 Opticent). הערה: קודי MATLAB זמינים בקובץ משלים 1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הדמיה קונפוקלית Ex vivo
<ol><li>המתת חסד של עכבר<ol><li>לאחר קבלת נתוני vis-OCT, הרדימו את העכברים עם תערובת של נתרן pentobarbital (390 מ"ג / מ"ל) ונתרן phenytoin (50mg / mL). Phenytoin נתרן פונקציות על ידי הגברת ההשפעות של נתרן pentobarbital, אשר יושם באופן נרחב המתת חסד מכרסם14,15. עבור כל עכבר, השתמש ב- 0.2 מ"ל / 20 גרם של תערובת מדוללת (156 מ"ג / מ"ל) ונקב עם 20 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) ולאחר מכן, 20 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב- PBS16,17.</li>
	</ol></li>
	<li>דיסקציה והתמצאות של העין<ol><li>לחנך את העיניים ולעשות סימן על הצד הטמפורלי כדי לציין את הכיוון.</li>
		<li>לאחר הסרה זהירה של החדר הקדמי, עדשת העין, הזגוגית ומקבעים את המשקפיים ב- PFA למשך 30 דקות.</li>
		<li>שטפו את המשקפיים עם PBS למשך 30 דקות, והחליפו את תמיסת PBS 3x במהלך הכביסה. לאחר מכן, שטפו עם 0.5% Triton X-100 ב-PBS (pH 7.5) למשך 30 דקות.</li>
		<li>יש לדגור על המשקפיים בחיץ חוסם (5% סרום חמורים עם 2.5% אלבומין בסרום בקר ו-0.5% טריטון X-100 במי מלח חוצצים טריס [pH 7.5]) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li>
	<li>אימונוסטיין הערה: המשקפיים מוכנים כעת להיות מוכתמים עם נוגדנים ראשוניים של עכבר anti-Tuj1 כדי לזהות חבילות אקסון RGC וחולדה anti-ICAM-2 כדי לזהות כלי דם.<ol><li>יש לדגור על כוסות העיניים למשך הלילה עם הנוגדנים הראשוניים, עכבר אנטי-Tuj1 (1:200 בחיץ חוסם) וחולדה אנטי-ICAM-2 (1:500 בחיץ חוסם), בטמפרטורה של 4°C.</li>
		<li>שטפו את המשקפיים 3-5x במשך שעה אחת בכל פעם, עם תמיסת מלח חוצצת פוספט המכילה 0.5% Triton X-100 (PBST) כדי למזער את הרקע ולהסיר נוגדנים לא קשורים.</li>
		<li>לאחר השטיפה, יש לדגור על כוסות העיניים למשך הלילה עם הנוגדנים המשניים, חמור אנטי-עכברי אימונוגלובולין G מצומד לצבע אלקסה פלואור 488 (פלואורסצנטיות ירוקה) וחמור נגד חולדה IgG מצומד לצבע אלקסה פלואור 594 (פלואורסצנטיות אדומה), כולם מדוללים בקנ"מ 1:1000 בחיץ חוסם, ב-4°C.</li>
		<li>למחרת, שטפו את המשקפיים 3-5x במשך שעה כל אחד עם PBST כדי למזער את הרקע ולהסיר נוגדנים לא קשורים.</li>
		<li>מעבירים את המשקפיים לצלחת פטרי של PBS לפני ההרכבה השטוחה.</li>
	</ol></li>
	<li>רשתית שטוחה<ol><li>לאחר תהליך הצביעה החיסונית, בודדו את הרשתית מהמשקפיים מתחת למיקרוסקופ.</li>
		<li>חתכו את הרשתית לארבעה עלים והרכיבו אותם בצורה שטוחה כששכבת ה-RGC פונה כלפי מעלה. השאר את הסימן בצד הרקתי המחובר לרשתית כדי לציין התמצאות.</li>
		<li>מכסים את הרשתית באמצעי הרכבה13,18. אטמו את המגלשות בלק13,18,19.</li>
	</ol></li>
	<li>הדמיה קונפוקלית הערה: עיבוד התמונה של תמונות קונפוקליות בוצע באמצעות תוכנת ZEN Microscopy.<ol><li>הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי, ותחת מצב אתר, מצא את אזור העניין באמצעות עינית המיקרוסקופ.</li>
		<li>במצב רכישה, הגדר אריחים לכיסוי כל הרשתית ופרוסות מחסנית z כדי לכסות את כל שכבות המידע. תמונה של לפחות 25 אריחים לאורך הרשתית כולה כדי לכסות את הנפח הכולל של 5.99 מ"מ (x) x 5.88 מ"מ (y) x 30 μm (z) בגודל פיקסל של 1.24 μm/pixel.</li>
		<li>הקרן את פרוסות ערימת Z כדי ליצור תמונות דו-ממדיות במיקרוסקופ קונפוקלי (איור 1C,D)11,13,19,20,21.</li>
	</ol></li>
</ol>3. יישור של תמונות in vivo ו- ex vivo
<ol><li>לאחר עיבוד הפיברגרם, צור תמונה מורכבת הכוללת את ארבע התמונות המתקבלות מכל עכבר על ידי יישור כל כלי הדם עם עורך גרפי לפי בחירתך. הערה: בממוצע, התמונה הסופית ללא הפרדות צבע היא בערך 1.2 מ"מ (x) x 1.2 מ"מ (y), כפי שמוצג באיור 1B.</li>
	<li>השתמש בראש עצב הראייה (ONH) ובתבנית כלי הדם כציוני דרך ליישור הסיב המרוכב. השג את היישור in vivo ו- ex vivo על ידי חפיפה של תבנית כלי הדם של תמונות OCT מרוכבות עם תמונות קונפוקליות של אותה רשתית מוכתמת ב- ICAM-2 .</li>
</ol>

יישור פיברגרם OCT של רשתית העכבר עם תמונות קונפוקליות

<ol>
	<li>Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+retinal+ganglion+cell+structure+and+function.">Development of retinal ganglion cell structure and function.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).</li><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+types+of+retinal+ganglion+cells:+current+status+and+implications+for+neuronal+classification.">The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li><li>Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture,+function,+and+assembly+of+the+mouse+visual+system.">Architecture, function, and assembly of the mouse visual system.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).</li><li>Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+function,+organization,+and+development+of+the+mouse+superior+colliculus.">Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus.</a> Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).</li><li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+glaucomatous+optic+neuropathy:+the+synergy+between+clinical+observation+and+investigation.">Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation.</a> Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).</li><li>Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glaucoma:+thinking+in+new+ways-a+role+for+autonomous+axonal+self-destruction+and+other+compartmentalised+processes.">Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).</li><li>Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+injury+signaling+and+compartmentalized+injury+response+in+glaucoma.">Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).</li><li>Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-dependent+morphological+and+functional+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+mouse+models+of+experimental+glaucoma.">Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma.</a> Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).</li><li>Tatham, A. J., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+structural+progression+in+glaucoma+with+optical+coherence+tomography.">Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography.</a> Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).</li><li>Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible-light+optical+coherence+tomography:+a+review.">Visible-light optical coherence tomography: a review.</a> Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).</li><li>Miller, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy+for+quantitative+imaging+of+retinal+ganglion+cell+axon+bundles.">Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).</li><li>Beckmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+inner+retinal+layer+structure+in+mice+after+eye-opening+using+visible-light+optical+coherence+tomography.">In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography.</a> Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).</li><li>Grannonico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+damages+in+retinal+ganglion+cell+axon+bundles+monitored+non-invasively+by+visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy.">Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy.</a> Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).</li><li>Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+Injection+of+Ethanol+for+the+Euthanasia+of+Laboratory+Mice+(Mus+musculus)+and+Rats+(Rattus+norvegicus).">Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).</li><li>Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologic,+Behavioral,+and+Histologic+Responses+to+Various+Euthanasia+Methods+in+C57BL/6NTac+Male+Mice.">Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+degeneration+of+retinal+and+superior+collicular+functions+in+mice+with+sustained+ocular+hypertension.">Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).</li><li>Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+laser-induced+mouse+model+of+chronic+ocular+hypertension+to+characterize+visual+defects.">A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+experimental+glaucoma+on+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+in+mice.">Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice.</a> Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).</li><li>Thomson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-1+knockout+mice+as+a+genetic+model+of+open-angle+glaucoma.">Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).</li><li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+ocular+hypertension+induces+dendritic+degeneration+of+mouse+retinal+ganglion+cells+that+depends+on+cell+type+and+location.">Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).</li><li>Grannonico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+analysis+of+retinal+ganglion+cell+damage+at+individual+axon+bundle+level+in+mice+using+visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy.">Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy.</a> Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).</li></ol>

צ'אנג, ס', אין; שו, ו', אין; אוהד, ו', אין; מקדניאל, ג'יי, אין; ד.א. מילר, ללא; מ. גרנוניקו, ללא; מ. ליו, ללא; X. ליו, ללא; לה.פ. ג'אנג יש אינטרסים כלכליים בחברת Opticent Health, שלא תמכה בעבודה זו.

ישנם שני שלבים בפרוטוקול זה הדורשים תשומת לב. ראשית, יש לוודא כי בעל החיים נמצא תחת הרדמה עמוקה וכי העיניים שלהם מורחבות לחלוטין לפני הדמיה vis-OCT. אם העכברים אינם מורדמים כראוי, נשימתם המהירה עלולה להוביל לתנועות לא יציבות של תמונות הפנים , מה שעלול להשפיע לרעה על איכות הסיבגרם. יתר על כ?...

תאי גנגליון ברשתית (RGCs) ממלאים תפקיד קריטי בעיבוד מידע חזותי, מקבלים קלט סינפטי דרך העצים הדנדריטיים שלהם בשכבת הפרספקס הפנימית (IPL) ומעבירים את המידע דרך האקסונים שלהם בשכבת סיבי עצב הרשתית (RNFL) למוח 1,2,3,4. במצבים חולים כגון גלאוקומה, ניוון RGC מוקדם עלול לגרום לשינויים עדינים ב- RNFL, בשכבת תאי הגנגליון (GCL), ב- IPL ובעצב הראייה הן בחולים והן בדגמי מכרסמים 5,6,7,8,9. גילוי מוקדם של שינויים מורפולוגיים אלה ב- RGCs חיוני אפוא להתערבות בזמן למניעת RGC ואובדן ראייה.
לאחרונה פיתחנו טכנולוגיית הדמיה חדשה מוכנה קלינית הנקראת טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של אור נראה (vis-OCT) כדי לספק את הצורך בניטור in vivo של נזקי RGC. Vis-OCT שיפר את הרזולוציה הצירית, והגיע ל-1.3 מיקרומטר ברשתית10,11, מה שאיפשר הדמיה של צרורות אקסונים בודדים של RGC ב-RNFL. לאחר מכן, סיבים vis-OCT (vis-OCTF) הוקמה כדי לעקוב ולכמת את נזקי RGC ברמת צרור האקסון היחיד בעכברים11,12,13. עם זאת, הדמיה קונפוקלית ex vivo של אותה רשתית כמו תקן הזהב נחוצה לעתים קרובות כדי לאמת את ממצאי in vivo. לכן, מחקר זה ידגים כיצד ליישר תמונות in vivo שנרכשו על ידי vis-OCTF עם תמונות קונפוקליות ex vivo של אותה רשתית עכבר. מטרת הפרוטוקול היא לאמת את ממצאי in vivo באמצעות הדמיה קונפוקלית ex vivo ולבסס בסיס לבחינת השינויים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס נזקי RGC במצבי מחלה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo 100</td>
			<td>Opticent Health, Evanston, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs and antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Santz Cruz Biotechnology, SC-281692</td>
			<td></td>
			<td>1-2 drops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin powder</td>
			<td>Fisher Scientific, BP9706-100</td>
			<td></td>
			<td>1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202</td>
			<td></td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209</td>
			<td></td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))</td>
			<td>Covetrus, NDC 11695-4860-1</td>
			<td></td>
			<td>15.6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Covetrus, NADA043304</td>
			<td></td>
			<td>114 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Tuj1</td>
			<td>A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia</td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum(NDS)</td>
			<td>Millipore Sigma, S30-100 mL</td>
			<td></td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 
			(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3</td>
			<td></td>
			<td>1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-ICAM-2</td>
			<td>BD Pharmingen, Cat#553325</td>
			<td></td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide drops&#160;</td>
			<td>Covetrus, NDC17478-102-12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 
			(Reagent Grade)</td>
			<td>VWR, CAS: 9002-93-1</td>
			<td></td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories Inc. H2000-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Covetrus, NDC59399-110-20</td>
			<td></td>
			<td>17 mg/kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alignment of visible-light optical coherence tomography fibergrams with confocal images of the same mouse retina

בשנים האחרונות, הדמיית רשתית in vivo , המספקת מידע לא פולשני, בזמן אמת ואורך על מערכות ותהליכים ביולוגיים, מיושמת יותר ויותר כדי לקבל הערכה אובייקטיבית של נזק עצבי במחלות עיניים. הדמיה קונפוקלית Ex vivo של אותה רשתית נחוצה לעתים קרובות כדי לאמת את ממצאי in vivo במיוחד במחקר בבעלי חיים. במחקר זה הדגמנו שיטה ליישור תמונה קונפוקלית ex vivo של רשתית העכבר עם תמונות in vivo שלה. טכנולוגיית הדמיה קלינית חדשה הנקראת סיבוגרפיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של אור נראה (vis-OCTF) יושמה כדי לרכוש תמונות in vivo של רשתית העכבר. לאחר מכן ביצענו הדמיה קונפוקלית של אותה רשתית כמו "תקן הזהב" כדי לאמת את תמונות in vivo מול OCTF. מחקר זה לא רק מאפשר חקירה נוספת של המנגנונים המולקולריים והתאיים, אלא גם מבסס בסיס להערכה רגישה ואובייקטיבית של נזק עצבי in vivo.

Retinal ganglion cells (RGCs) play a critical role in visual information processing, receiving synaptic inputs through their dendritic trees in the inner plexiform layer (IPL) and transmitting the information via their axons in the retinal nerve fiber layer (RNFL) to the brain1,2,3,4. In diseased conditions such as glaucoma, early RGC degeneration may result in subtle changes in the RNFL, the ganglion cell layer (GCL), the IPL, and the optic nerve in both patients and rodent models5,6,7,8,9. Early detection of these morphological changes in RGCs is thus essential for timely intervention to prevent RGC and vision loss.
We have recently developed a new clinical-ready imaging technology called visible-light optical coherence tomography (vis-OCT) to satisfy the need for in vivo monitoring of RGC damage. Vis-OCT improved the axial resolution, reaching 1.3 &#181;m in the retina10, 11, allowing for the visualization of individual RGC axon bundles in the RNFL. Subsequently, vis-OCT fibergraphy (vis-OCTF) was established to track and quantify RGC damage at the single axon bundle level in mice11,12,13. However, ex vivo confocal imaging of the same retina as the gold standard is often necessary to validate the in vivo findings. Therefore, this study will demonstrate how to align in vivo images acquired by vis-OCTF with ex vivo confocal images of the same mouse retina. The protocol aims to validate the in vivo findings by ex vivo confocal imaging and establish a foundation for examining the molecular and cellular changes underlying RGC damage in diseased conditions.

מחבר זרקור: התקדמות בהדמיית הרשתית In Vivo ו- Ex Vivo לשיפור אבחון וטיפול בגלאוקומה 

יישור של טומוגרפיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של אור נראה עם תמונות קונפוקליות של אותה רשתית עכבר

We present a protocol for aligning in vivo VIS-OCT images with ex vivo immunostained retinal nerve fibers to validate our novel imaging technology. VIS-OCT enables visualization of retinal nerve fibers in vivo, and this process confirms the accuracy of our findings. Our protocol combines in vivo and ex vivo imaging to provide a real time visualization of retina structure and confirm findings.The process is applicable to mouse models of eye diseases, provided the anterior eye portion allows for optical imaging. This includes diabetic retinopathy and retinal ischemia models. These studies lay the foundation for establishing an objective evaluation of neuro damage in humans, which can significantly improve glaucoma diagnosis and treatment in the future.

הסיבגרם המרוכב vis-OCT מושווה לתמונה קונפוקלית מקבילה של רשתית שטוחה עם Tuj-1 עבור אקסוני RGC (איור 1D, פאנל עליון). ניתן להתאים צרורות אקסונים שצולמו על ידי vis-OCTF עם חבילות האקסון המסומנות ב- Tu-j1 בתמונה הקונפוקלית. כלי דם בדרך כלל מציגים מבנים מסתעפים מובחנים בהשוואה לצרורות האקסון ...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment at JoVE.com

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים ליישור תמונות טומוגרפיה של טומוגרפיה קוהרנטית אופטית באור נראה (vis-OCTF) עם תמונות קונפוקליות ex vivo של אותה רשתית עכבר לצורך אימות המורפולוגיה של צרור האקסון של תאי גנגליון הרשתית שנצפו בתמונות in vivo .

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

אנו מציגים פרוטוקול ליישור תמונות in vivo VIS-OCT עם סיבי עצב רשתית מוכתם חיסוני ex vivo כדי לאמת את טכנולוגיית ההדמיה החדשנית שלנו. VIS-OCT מאפשר הדמיה של סיבי עצב הרשתית in vivo, ותהליך זה מאשר את דיוק הממצאים שלנו. הפרוטוקול שלנו משלב הדמיה in vivo ו- ex vivo כדי לספק הדמיה בזמן אמת של מבנה הרשתית ולאשר את הממצאים.התהליך ישים למודלים עכבריים של מחלות עיניים, בתנאי שחלק העין הקדמית מאפשר הדמיה אופטית. זה כולל רטינופתיה סוכרתית ומודלים איסכמיה ברשתית. מחקרים אלה מניחים את הבסיס לביסוס הערכה אובייקטיבית של נזק עצבי בבני אדם, אשר יכולה לשפר באופן משמעותי את האבחון והטיפול בגלאוקומה בעתיד.

alignment-visible-light-optical-coherence-tomography-fibergrams-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

886 Views.  University of Virginia. אנו מציגים פרוטוקול ליישור תמונות in vivo VIS-OCT עם סיבי עצב רשתית מוכתם חיסוני ex vivo כדי לאמת את טכנולוגיית ההדמיה החדשנית שלנו. VIS-OCT מאפשר הדמיה של סיבי עצב הרשתית in vivo, ותהליך זה מאשר את דיוק הממצאים שלנו. הפרוטוקול שלנו משלב הדמיה in vivo ו- ex vivo כדי לספק הדמיה בזמן אמת של מבנה הרשתי...

Video: מחבר זרקור: התקדמות בהדמיית הרשתית In Vivo ו- Ex Vivo לשיפור אבחון וטיפול בגלאוקומה 

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

In Vivo Visible Light Optical Coherence Tomography (OCT) Mouse Retinal Imaging

Start by positioning the anesthetized mouse on the animal holder and securing it with two Velcro straps. Turn on the computer and open the software to activate the laser. Adjust the animal holder to center the laser in the mouse's eye.Visualize the posterior part through an on-face preview, the field of view of the superficial vascular plexus, a B scan, and the retina cross-section within the field of view. Acquire a visible light optical coherence tomography, or vis-OCT volume after making minor adjustments to the optical focus. Align the optical nerve head in each of the four corners of the field of view to cover different retinal areas.Use an intensity-based threshold method to detect the retina surface, and generate vis-OCT fiber grams from the volume. Crop the retinal nerve fiber layer, or RNFL, by selecting the first 16 micrometers depth. Next, calculate the mean intensity projection along the axial direction to generate the fiber gram image composed of retinal ganglion cell axon bundles and surrounding vasculature.Align the blood vessels using a graphics editor to montage the four images post-processing. The composite vis-OCT fiber gram is compared with the corresponding confocal image of flat-mounted retina immunostained with TUJ1 for RGC axons. Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM II labeled blood vessels on the confocal image.Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-OCT revealed identical RGC exon bundle networks and surrounding retinal vasculature.

ב- Vivo Visible Light טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית (OCT) הדמיית רשתית עכבר

Ex Vivo Confocal Imaging of Mouse Retina

Enucleate the eyes of a euthanized mouse, marking the temporal side for orientation purposes. Remove the anterior chamber. Then remove the lens and vitreous and place eye cups in paraformaldehyde for 30 minutes.Wash eye cups with PBS for 30 minutes. Replacing the solution three times. Then, wash with 0.5%Triton X-100 for 30 minutes.Incubate eye cups in the blocking buffer for two hours at room temperature. After immunostaining, isolate the retinas from the eye cups using a microscope. Divide the retinas into four leaves and flat mount them with the retinal ganglion cell layer facing up.Ensure the mark on the temporal side remains attached for orientation. Cover the retinas with mounting medium. Place cover slips.And seal the slides using nail polish. Turn on the confocal microscope and under Locate mode, find the area of interest using the eye piece. Switch to Acquisition mode and set up tiles to cover the entire retina, along with Z-Stack slices for all layers of information.Image at least 25 tiles across the whole retina to achieve a total volume. Project the Z-Stack slices to generate two-dimensional on-face confocal microscopy images. The composite vis-OCT fibergram is compared with the corresponding confocal image of flat mounted retina immunostained with TuJ1 for RGC axons.Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM-2 labeled blood vessels on the confocal image. Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-OCT revealed identical RGC axon bundle networks and surrounding retinal vasculature.

Alignment of In Vivo and Ex Vivo Mouse Retinal Images

Start by creating a composite image using the four obtained images from each mouse. Utilize a graphics editor to align all the blood vessels, employ the optic nerve head and blood vessel patterns as landmarks for aligning the composite fiber gram overlap the composite images and the confocal images of the same retina stained with ICAM2, to achieve in vivo and ex vivo alignment. The composite vis-oct fiber gram is compared with the corresponding confocal image of flat mounted retina.Immuno stain with TUJ1 for RGC axons. Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM2 labeled blood vessels on the confocal image. Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-oct revealed identical RGC Axon bundle networks and surrounding retinal vasculature.