تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة SRB الخيرية ، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) P30EY002520 ، ومنحة مؤسسية غير مقيدة من أبحاث الوقاية من العمى (RPB) إلى قسم طب العيون ، كلية بايلور للطب. يتم دعم WL من قبل مؤسسة Knights Templar Eye Foundation في طب العيون.

تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية ، بما في ذلك الإجراءات التجريبية والقتل الرحيم ، من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في كلية بايلور للطب برقم البروتوكول AN-8790.
1. تحضير 1 N هيدروكسيد الصوديوم
<ol><li>أضف 4 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. قم بوزن 400 مجم من هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ، وأضفه إلى الأنبوب بعناية.</li>
	<li>قم بإذابة هيدروكسيد الصوديوم عن طريق تحريك المحلول ببطء باستخدام قضيب زجاجي. قم بتكوين الحجم إلى 10 مل عن طريق إضافة ماء منزوع الأيونات معقم إلى الأنبوب ، واخلطه مرة أخرى عن طريق قلب الأنبوب برفق لأعلى ولأسفل. أغلق الغطاء بإحكام ، وقم بتخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>قم بإعداد المحلول الطازج كل شهر لأن تركيز محلول NaOH قد ينخفض عن طريق امتصاص المحلول لثاني أكسيد الكربون في الهواء.</li>
	<li>امزج دائما محلول هيدروكسيد الصوديوم برفق قبل الاستخدام. تنبيه: قم بإعداد المحلول داخل غطاء كيميائي ، وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE).</li>
</ol>2. تحضير محلول بارافورمالدهيد 4٪ (PFA)
<ol><li>أضف 30 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى دورق زجاجي. قم بوزن 4 جم من بارافورمالدهيد (PFA) ، وأضفه إلى الدورق.</li>
	<li>احتفظ بالكأس على طبق ساخن على حرارة 60 درجة مئوية مع التحريك. أضف محلول 1 N NaOH بالتنقيط لرفع الأس الهيدروجيني حتى يزول المحلول.</li>
	<li>تحقق واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام 1 N حمض الهيدروكلوريك (HCl). اضبط مستوى الصوت النهائي على 50 مل باستخدام 1x PBS.</li>
	<li>تبريد وتصفية الحل. يخزن المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية. تنبيه: قم بإعداد المحلول في غطاء دخان أثناء ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.</li>
</ol>3. تحضير كوكتيل الكيتامين / الزيلازين
<ol><li>قم بإعداد كوكتيل الكيتامين / الزيلازين بإضافة 0.8 مل من الكيتامين (تركيز المخزون: 100 مجم / مل) و 0.16 مل من الزيلازين (تركيز المخزون: 100 مجم / مل) إلى 9.4 مل من المحلول الملحي.</li>
	<li>قم بتخزين الكوكتيل في زجاجات حقن معقمة في درجة حرارة الغرفة (RT).</li>
</ol>4. حرق القلويات على القرنية الماوس
<ol><li>حقن ميلوكسيكام (4-6 ملغ/كغ من وزن الجسم) تحت الجلد قبل 30 دقيقة من الإجراء لتخفيف الآلام. تخدير الفئران (C57BL/6J، 6-8 أسابيع من العمر، ذكر) باستخدام حقنة i.p. من كوكتيل الكيتامين/الزيلازين (الكيتامين 80 ملغم/كغم والزيلازين 16 ملغم/كغم من وزن الجسم).</li>
	<li>تحقق من استجابة الانعكاس (سحب الدواسة) عن طريق الضغط على أصابع الماوس ، وتأكد من عدم وجود المنعكس. ضع قطرة واحدة من المخدر الموضعي ، 0.5٪ بروباراكائين ، على سطح القرنية في عين واحدة ، وقطرة من الدموع الاصطناعية على العين الأخرى.</li>
	<li>باستخدام لكمة خزعة 2 مم ، قم بإخراج أقراص ورق الترشيح Whatman.</li>
	<li>أضف 2 ميكرولتر من 1N NaOH إلى طبق بتري نظيف. ضع قرص ورق الترشيح مقاس 2 مم على قطرة 1 N NaOH ، واتركه ينقع لمدة 15 ثانية.</li>
	<li>التقط ورق الترشيح بالملقط ، وضع ورق الترشيح على العين المعالجة بالبروباراكايين في وسط القرنية لمدة 30 ثانية. ملاحظة: يجب أن يلامس ورق الترشيح مركز القرنية فقط ، ويجب توخي الحذر لتجنب حركة ورق الترشيح بمجرد وضعه ، لأن تحريك ورق الترشيح يمكن أن يسبب حروقا في الأنسجة المجاورة.</li>
	<li>اغسل العين عن طريق التنظيف ب 20 مل من محلول ملحي معقم في حقنة معقمة. ملاحظة: يجب توخي الحذر لضمان غسل القرنية ، جنبا إلى جنب مع كيس الملتحمة ، جيدا لضمان عدم حدوث مزيد من الضرر للقرنية أو الأنسجة المحيطة. غسل كيس الملتحمة سيمنع سيمبلفارون.</li>
	<li>امسح المحلول الملحي الزائد برفق عن العينين والمنطقة المحيطة باستخدام مناديل ناعمة يمكن التخلص منها. بعد ذلك ، احتفظ بالفئران في قفص التعافي على وسادة تدفئة دافئة حتى تصبح متنقلة. ملاحظة: تتم مراقبة الفئران يوميا بعد حرق القلويات لمدة 3 أيام. إذا لوحظت أعراض الألم أو الإجهاد ، يتم إعطاء ميلوكسيكام (4-6 ملغ / كغ من وزن الجسم) تحت الجلد.</li>
</ol>5. فحص وتقييم الأوعية الدموية الجديدة والعتامة
<ol><li>في الفئران المخدرة ، افحص العينين تحت مجهر التشريح في اليوم 10 بعد الحرق ، واحصل على صور باستخدام كاميرا متصلة بمنظار التشريح لتسجيل العتامة والأوعية الدموية الجديدة. ملاحظة: يكفي إجراء منظار تشريح منتظم مزود بكاميرا.</li>
	<li>أثناء مراقبة القرنية من خلال مجهر التشريح ، قم بتسجيل العتامة بعد الحرق بناء على المقياس التالي12: 0 = لا عتامة ؛ القرنية واضحة 1 = عتامة خفيفة ؛ ضبابية طفيفة في مناطق القزحية والتلاميذ ؛ القزحية والتلميذ مرئية بسهولة 2 = عتامة معتدلة ؛ القزحية والتلميذ بالكاد مرئية 3 = عتامة شديدة. القزحية أو التلميذ غير مرئي 4 = قرنية معتمة. القزحية والتلميذ غير مرئيين</li>
	<li>أثناء مراقبة القرنية من خلال مجهر التشريح ، قم بتسجيل CoNV بناء على المقياس التالي12: 0 = لا الأوعية الدموية الجديدة. لا سفن جديدة من ليمبوس 1 = الأوعية الدموية الخفيفة ؛ السفن الجديدة الناشئة من ليمبوس 2 = الأوعية الدموية الحديثة المعتدلة. نشأت الأوعية الدموية من الليمبوس وتنمو نحو مركز القرنية 3 = الأوعية الدموية الجديدة الشديدة. الأوعية الدموية التي تنشأ من الليمبوس وتصل إلى و / أو تعبر مركز القرنية</li>
	<li>استخدم اختبار t الخاص بالطالب لمقارنة درجات العتامة والأوعية الدموية الجديدة إحصائيا بين الحروق القلوية ومجموعات العين الصحية.</li>
	<li>القتل الرحيم للفئران في اليوم 10 عن طريق التعرض للأيزوفلوران بنسبة 5٪ حتى 1 دقيقة بعد توقف التنفس ، يليه خلع عنق الرحم ، وجمع القرنيات للتصوير المسطح.</li>
</ol>6. التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT)
<ol><li>التقط صور OCT للجزء الأمامي من العين في الفئران المخدرة في اليوم 10 بعد الحرق. قم بإجراء الحصول على صورة OCT كمسح ضوئي لوحدة التخزين باستخدام وضع IR + OCT مع مجال رؤية 30 درجة وكثافة الأشعة تحت الحمراء بنسبة 100٪.</li>
	<li>تحديد سمك القرنيات باستخدام برنامج ImageJ.</li>
	<li>لقياس السماكة، استخدم أداة تحديد الخط في برنامج ImageJ لإنشاء خط مستقيم بين السطحين الأمامي والخلفي عند القرنية المركزية.</li>
	<li>انقر فوق تحليل > قياس في أدوات البرنامج لنقل القيم إلى نافذة البيانات.</li>
	<li>انسخ القيم إلى ملف جدول بيانات ، وقارن إحصائيا سمك القرنية بين حرق القلويات ومجموعات العين السليمة باستخدام اختبار t للطالب. ملاحظة: سمك القرنية هو المسافة من نقطة على سطح القرنية الأمامي إلى أقرب نقطة على سطح القرنية الخلفي في مركز القرنية.</li>
</ol>7. تلطيخ مناعي ل CoNV على القرنيات المسطحة
<ol><li>القتل الرحيم للفئران في اليوم 10 بعد حرق القلويات ، واستئصال العينين عن طريق تشريح حاد.</li>
	<li>اسحب الجفون بعيدا باستخدام إصبعي الإبهام والسبابة ، وضع ملقط تحت كرة العين. أغلق الملقط ، واسحب مقلة العين برفق من المدار.</li>
	<li>ضع مقل العيون في 1x PBS. لكل مقلة عين ، قم بإزالة القرنية من كرة العين عن طريق إجراء شق أولا باستخدام إبرة 30 جم أسفل منطقة الليمبوس.</li>
	<li>قطع حول منطقة النسيان باستخدام مقص القرنية الدقيقة ، مع شق كنقطة انطلاق ، وفصل القرنية والحافة ببطء عن الكرة الأرضية.</li>
	<li>نظف القرنيات برفق باستخدام فرشاة رسم دقيقة لإزالة القزحية. إصلاح القرنيات في 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 1 ساعة.</li>
	<li>اغسل القرنيات ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة لكل منها في 1x PBS في درجة حرارة الغرفة (RT).</li>
	<li>احتضان في مخزن مؤقت مانع (1x PBS مكمل ب 0.1٪ Triton-X 100 و 5٪ ألبومين مصل بقري [BSA]) لمدة 1 ساعة في RT.</li>
	<li>نقل القرنيات إلى محلول الأجسام المضادة الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة في 1x PBS المكمل ب 1٪ BSA و 0.1٪ Triton-X 100 و Dylight550 المترافق المضاد ل CD31 mAb (1: 100) و Alexa Fluor488-conjugated anti-LYVE-1 mAb (1: 100).</li>
	<li>احتضان لمدة 3 أيام عند 4 درجات مئوية. اغسل القرنيات في 1x PBS ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة لكل منهما.</li>
	<li>قم بتلطيخ النوى باستخدام محلول البقع Hoechst (1: 1000) لمدة 5 دقائق في الظلام.</li>
	<li>قم بتسطيح القرنيات بجروح شعاعية ، وقم بتثبيتها على شريحة زجاجية تم تنظيفها مسبقا باستخدام وسيط التثبيت وأغطية الغطاء. أغلق أغطية الغطاء بطلاء أظافر شفاف ، وجفف الشرائح طوال الليل في الظلام قبل تحليلها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.</li>
	<li>تصوير القرنيات المثبتة بشكل مسطح باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر عن طريق خياطة صور Z-stack الفردية ؛ استخدم هدف 10x ، ليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر ، ودقة 512 بكسل × 512 بكسل لكل شريحة على ماسحات Galvano غير الرنانة.</li>
	<li>حدد كثافة الدم CD31 + والأوعية الليمفاوية LYVE-1 + باستخدام برنامج ImageJ.</li>
	<li>لتحديد كثافة الأوعية الدموية ، قم بتحويل الصور متحدة البؤر إلى صورة 8 بت.</li>
	<li>اختر كثافة الأوعية الدموية من المكونات الإضافية.</li>
	<li>اختر منطقة الاهتمام على الصورة ، وانقر فوق موافق. سيتم فتح القياسات في نافذة بيانات جديدة.</li>
	<li>انسخ القيم إلى ملف جدول بيانات ، وقارن إحصائيا كثافة الأوعية الدموية بين الحرق القلوي ومجموعات العين السليمة باستخدام اختبار t للطالب. ملاحظة: CD31 ، ويسمى أيضا جزيء التصاق الخلايا البطانية للصفائح الدموية -1 (PECAM-1) ، هو جزيء التصاق خلوي يشارك في تكوين الأوعية ويتم التعبير عنه بشكل كبير في الخلايا البطانية للأوعية الدموية المبكرة والناضجة13. LYVE-1 (مستقبل الهيالورونان البطاني للأوعية اللمفاوية -1) هو علامة سطح الخلية على الخلايا البطانية اللمفاوية ويمكن استخدامه كعلامة تكوين الأوعية اللمفاوية14.</li>
</ol>

التوعي الكلوي للقرنية الناجم عن الحرق القلوي في الفئران

<ol>
	<li>Ellenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+aspects+of+corneal+angiogenic+and+lymphangiogenic+privilege.">Novel aspects of corneal angiogenic and lymphangiogenic privilege.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (3), 208-248 (2010).</li><li>Azar, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+angiogenic+privilege:+Angiogenic+and+antiangiogenic+factors+in+corneal+avascularity,+vasculogenesis,+and+wound+healing+(an+American+Ophthalmological+Society+thesis).">Corneal angiogenic privilege: Angiogenic and antiangiogenic factors in corneal avascularity, vasculogenesis, and wound healing (an American Ophthalmological Society thesis).</a> Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 264-302 (2006).</li><li>Rolfsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+neovascularization:+A+review+of+the+molecular+biology+and+current+therapies.">Corneal neovascularization: A review of the molecular biology and current therapies.</a> Expert Review of Ophthalmology. 8 (2), 167-189 (2013).</li><li>Skobe, M., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+the+path+of+lymphatic+vessels.">Blocking the path of lymphatic vessels.</a> Nature Medicine. 15 (9), 993-994 (2009).</li><li>Lee, P., Wang, C. C., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+neovascularization:+An+epidemiologic+review.">Ocular neovascularization: An epidemiologic review.</a> Survey of Ophthalmology. 43 (3), 245-269 (1998).</li><li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacious,+safe,+and+stable+inhibition+of+corneal+neovascularization+by+AAV-vectored+anti-VEGF+therapeutics.">Efficacious, safe, and stable inhibition of corneal neovascularization by AAV-vectored anti-VEGF therapeutics.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 22, 107-121 (2021).</li><li>Lasagni Vitar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+corneal+neovascularization+and+its+impact+on+visual+acuity+and+sensitivity:+A+14-year+retrospective+study.">Epidemiology of corneal neovascularization and its impact on visual acuity and sensitivity: A 14-year retrospective study.</a> Frontiers in Medicine. 8, 733538 (2021).</li><li>Said, D. G., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+burns+acid+or+alkali,+what's+the+difference.">Chemical burns acid or alkali, what's the difference.</a> Eye. 34, 1299-1300 (2020).</li><li>Muthukkaruppan, V. R., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+the+mouse+cornea.">Angiogenesis in the mouse cornea.</a> Science. 2 (4413), 1416-1418 (1979).</li><li>Kenyon, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+angiogenesis+in+the+mouse+cornea.">A model of angiogenesis in the mouse cornea.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 37 (8), 1625-1632 (1996).</li><li>Cursiefen, C., Maruyama, K., Jackson, D. G., Streilein, J. W., Kruse, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+angiogenesis+and+lymphangiogenesis+after+brief+corneal+inflammation.">Time course of angiogenesis and lymphangiogenesis after brief corneal inflammation.</a> Cornea. 25 (4), 443-447 (2006).</li><li>Yoeruek, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=penetration+and+efficacy+of+topically+applied+bevacizumab:+Evaluation+of+eyedrops+in+corneal+neovascularization+after+chemical+burn.">penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: Evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn.</a> Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).</li><li>DeLisser, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+endothelial+PECAM-1/CD31+in+angiogenesis.">Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis.</a> The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).</li><li>Johnson, L. A., Prevo, R., Clasper, S., Jackson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+uptake+and+degradation+of+the+lymphatic+endothelial+hyaluronan+receptor+LYVE-1.">Inflammation-induced uptake and degradation of the lymphatic endothelial hyaluronan receptor LYVE-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (46), 33671-33680 (2007).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+modeling+of+corneal+alkali+injury+in+the+rat+eye.">Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye.</a> Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).</li><li>Chung, J. H., Fagerholm, P., Lindstr&#246;m, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+corneal+epithelium+following+a+standardized+alkali+wound.">The behaviour of corneal epithelium following a standardized alkali wound.</a> Acta Ophthalmologica. 65 (5), 529-537 (1987).</li><li>Chang, J. H., Gabison, E. E., Kato, T., Azar, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+neovascularization.">Corneal neovascularization.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 12 (4), 242-249 (2001).</li><li>Alves da Costa, T., Lang, J., Torres, R. M., Pelanda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+human+immune+system+mice+and+their+use+to+study+tolerance+and+autoimmunity.">The development of human immune system mice and their use to study tolerance and autoimmunity.</a> Journal of Translational Autoimmunity. 2, 100021 (2019).</li><li>vander Weyden, L., White, J. K., Adams, D. J., Logan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+genetics+toolkit:+Revealing+function+and+mechanism.">The mouse genetics toolkit: Revealing function and mechanism.</a> Genome Biology. 12 (6), 224 (2011).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

القرنية هي نسيج ممتاز لدراسة تكوين الأوعية الدموية والالتهابات لأنه يمكن الوصول إليها والأوعية الدموية ، مما يعني أنه يمكن اكتشاف الأوعية الدموية الجديدة وتوثيقها بسهولة. تم استخدام حرق القرنية في الأرانب والجرذان والفئران لدراسة تكوين الأوعية الدموية في القرنية ، والالتهاب والعتامة ، والتقرح ، وانثقاب القرنية ، والتليف15،16،17. علاوة على ذلك ، فإن نموذج الفأر لحرق القرنية ذو قيمة لاختبار الاستراتيجيات العلاجية المختلفة لتكوين الأوعية والالتهاب لأن الفئران لديها جهاز مناعي يرتبط ارتباطا وثيقا بنظام البشر18. كما أن توفر تقنيات لمعالجة جينوم الفأر وراثيا يجعل الأنواع خيارا ممتازا لهذا النوع من الدراسة19. كان التحدي في هذا البحث هو تطوير طريقة لحرق القرنية توفر فيزيولوجيا مرضية متسقة وقابلة للتكرار.
نموذج الحرق القلوي مفيد بشكل خاص للفحص الدوائي للأدوية التي تعدل تكوين الأوعية والالتهاب والتليف. إن الحد الأدنى من متطلبات الكواشف والموارد ، وبساطة إجراء الحرق القلوي ، وفوائد المدة القصيرة للبروتوكول والملاحظة المباشرة للنتائج تجعل حرق القلويات على قرنية الفأر خيارا أساسيا لفحص الأدوية الدوائية. ومع ذلك ، ينبغي مراعاة بعض الاحتياطات عند تنفيذ هذا الإجراء لضمان الاتساق وقابلية التكاثر. أولا ، يجب وضع ورق الترشيح في وسط القرنية لتجنب حرق مناطق أخرى من العين ، وخاصة الأطراف والجفون والملتحمة. ثانيا ، يجب أن يكون حجم وتركيز هيدروكسيد الصوديوم مناسبا للحصول على نتائج متسقة من الحرق القلوي على القرنية. يجب ألا يكون المرشح مبللا ولكن يجب أن يكون منقوعا في محلول هيدروكسيد الصوديوم. تم تحسين حجم المرشح ونوع المرشح والحالة الطبيعية وحجم المحلول المستخدم في هذه الطريقة لتجنب تجاوز تدفق هيدروكسيد الصوديوم. قد يؤدي استخدام ورق ترشيح مختلف الحجم أو حجم أكبر أو أقل من NaOH إلى حدوث تناقضات في الأوعية الدموية الجديدة. ثالثا ، من المهم منع محلول NaOH من امتصاص CO2 في هواء الغرفة عن طريق شد غطاء أنبوب المحلول على الفور بعد الاستخدام وتقليل نسبة الهواء / المحلول. يجب توخي الحذر لاستخدام المحاليل القلوية الطازجة لمنع التناقضات في الأوعية الدموية الجديدة وتجنب تقرح القرنية. أخيرا ، من الضروري إجراء غسيل مكثف لجميع محلول NaOH من العين والملتحمة بالمحلول الملحي لمنع المزيد من الضرر للقرنية والأنسجة المحيطة بالعين. الغسيل الشامل للقرنية والأنسجة المجاورة سيمنع أيضا سيمبلفارون.
البروتوكول الموصوف هنا هو طريقة فعالة وموثوقة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لتكوين الأوعية الدموية في القرنية. يمكن استخدام هذا البروتوكول أيضا لدراسة التهاب القرنية والتليف والتئام الجروح.

القرنية هي نسيج لاوعائي يحافظ على شفافيته من خلال إنشاء امتياز وعائي 1,2. يمكن أن يؤدي تلف القرنية إلى التهاب وتطور الأوعية الدموية والليمفاوية ، وكذلك التليف3. يؤدي الأوعية الدموية القرنية (CoNV) إلى ضعف البصر وهو السبب الرئيسي الثاني للعمى في جميع أنحاء العالم4. يؤثر CoNV على حوالي 1.4 مليون شخص في الولايات المتحدة سنويا5. يمكن أن يحدث CoNV بعوامل مختلفة ، بما في ذلك الحروق الكيميائية والالتهابات والالتهابات ونقص الأكسجة 3,6. الحروق الكيميائية هي واحدة من أكثر حالات الطوارئ العينية شيوعا ، وهي تمثل حوالي 13.2٪ من إصابات العين وتتطلب تقييما وعلاجا فوريا7. يمكن أن تكون الحروق الكيميائية حروقا قلوية أو حمضية ، لكن الحروق القلوية تسبب إصابة أكثر شدة ، حيث تخترق القلويات أعمق في الأنسجة8.
تستخدم نماذج الفئران من حرق القلويات على نطاق واسع لدراسة CoNV والتئام الجروح. بالمقارنة مع نموذج تكوين الأوعية الدموية في جيب القرنية 9,10 ، فإن نماذج الحرق القلوي سهلة نسبيا ويمكن استخدامها أيضا لدراسة التهاب القرنية والتليف والانتشار الظهاري. ترتبط هذه النماذج أيضا ارتباطا وثيقا بالحروق الكيميائية السريرية أكثر من نماذج خياطة القرنية لتكوين الأوعيةالدموية 11. مع الحرق القلوي ، تطور القرنية اللاوعائية الأوعية الدموية بسبب الالتهاب وعدم التوازن في العوامل المضادة لتولد الأوعيةالدموية والمؤيدة لتولد الأوعية 1,2. تتمثل عيوب نماذج حرق القرنية القلوي في الصعوبات في التحكم في منطقة وشدة الحرق القلوي ، والتباين في الأوعية الدموية الجديدة للقرنية ، والحرق غير المقصود للأنسجة المجاورة بسبب المحلول القلوي الزائد. الغرض من هذه الدراسة هو وصف نموذج حرق قلوي للقرنية متحكم فيه في الفئران باستخدام ورق ترشيح منقوع مسبقا في محلول هيدروكسيد الصوديوم. يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة العوامل الوعائية ، والكواشف العلاجية المضادة لتولد الأوعية ، وغيرها من العوامل والكواشف التي يمكن أن تعدل الالتهاب والتليف.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>KL-7302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Needle</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>16-N3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Confocal</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-1642R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LYVE-1</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>53-0443-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASM Module</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td></td>
			<td>Anterior segment objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>16-1309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>22X22-1-601640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-4TZ-30WY-10M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gonak Hypromellose&#160;</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478006412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 9</td>
			<td>GraphPad Sotware, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>K&#38;H Pet Products</td>
			<td>100213018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRA + OCT Spectralis</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>Mckesson</td>
			<td>102-SN310C31516P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Kimberly Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic Slide</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone&#160;</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>24208-0795-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Serum</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>008-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine HCl</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>24208073006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1531042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ125</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>16-S10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TX1568-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann Filter Paper</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>WHA1003323</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model for corneal neovascularization by alkali burn

الأوعية الدموية القرنية (CoNV) ، وهو شكل مرضي من تكوين الأوعية الدموية ، ينطوي على نمو الأوعية الدموية والليمفاوية في القرنية اللاوعائية من الحافة ويؤثر سلبا على الشفافية والرؤية. الحرق القلوي هو أحد أكثر أشكال الصدمات العينية شيوعا التي تؤدي إلى CoNV. في هذا البروتوكول ، يتم تحفيز CoNV تجريبيا باستخدام محلول هيدروكسيد الصوديوم بطريقة خاضعة للرقابة لضمان التكاثر. يعد نموذج الحرق القلوي مفيدا لفهم أمراض CoNV ويمكن توسيعه لدراسة تكوين الأوعية بشكل عام بسبب الأوعية الدموية والشفافية وإمكانية الوصول إلى القرنية. في هذا العمل ، تم تحليل CoNV عن طريق الفحص المباشر تحت مجهر تشريح وعن طريق تلطيخ القرنيات المسطحة باستخدام مضاد CD31 mAb. تم الكشف عن تكوين الأوعية اللمفاوية على القرنيات المسطحة عن طريق التلوين المناعي باستخدام مضاد LYVE-1 mAb. تم تصور وذمة القرنية وقياسها باستخدام التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT). باختصار ، سيساعد هذا النموذج على تطوير فحوصات الأوعية الدموية الحديثة الحالية واكتشاف استراتيجيات علاجية جديدة لتكوين الأوعية الدموية المرضية للعين وخارج العين.

The cornea is an avascular tissue that maintains its transparency by establishing an angiogenic privilege1,2. Damage to the cornea can result in inflammation and the development of blood and lymph vessels, as well as fibrosis3. Corneal neovascularization (CoNV) leads to visual impairment and is the second leading cause of blindness worldwide4.&#160;CoNV affects about 1.4 million people in the United States per year5. CoNV can be induced by various factors, including chemical burns, infections, inflammation, and hypoxia3,6. Chemical burns are one of the most common ocular emergencies, and they account for about 13.2% of ocular trauma and require immediate assessment and treatment7. Chemical burns could be alkali or acid burns, but alkali burns cause more severe injury, as alkali penetrates deeper into the tissue8.
Mouse models of alkali burn are widely used to study CoNV and wound healing. Compared to the corneal pocket angiogenesis model9,10, alkali burn models are relatively straightforward to create and can also be used to study corneal inflammation, fibrosis, and epithelial proliferation. These models are also more closely related to clinical chemical burns than corneal suture models of angiogenesis11. With alkali burn, the otherwise avascular cornea develops blood vessels due to inflammation and an imbalance in anti-angiogenic and pro-angiogenic factors1,2. The drawbacks of corneal alkali burn models are the difficulties in controlling the area and severity of the alkali burn, the variation in corneal neovascularization, and unintentional burning of the adjacent tissues due to excess alkali solution. The purpose of this study is to describe a controlled corneal alkali burn model in mice using filter paper pre-soaked in sodium hydroxide solution. This model could be used to study angiogenic factors, anti-angiogenic therapeutic reagents, and other factors and reagents that could modulate inflammation and fibrosis.

تسليط الضوء على المؤلف: فك تشفير الأوعية الدموية القرنية باستخدام نموذج الحرق القلوي للاستراتيجيات العلاجية المستقبلية 

نموذج فأر للتوعي القرني عن طريق الحرق القلوي

We are trying to develop a highly reproducible model for inducing corneal neovascularization, and to identify the most relevant histological and immunostaining methods to monitor therapies to prevent and reduce neovascularization. The drawbacks of corneal alkali burn models are difficulties in controlling the area and severity of alkali burn, variation of corneal neovascularization, and unintentional burn of edges and tissues due to excess alkali solution. Corneal neovascularization is a site threatening condition.The pathogenesis of this condition is poorly understood. This model will be used to gain new insight into the condition, and to identify relevant therapeutic targets Compared to the corneal pocket angiogenesis model, alkali burn models are relatively straightforward to create, and can also be used to study corneal inflammation, fibrosis, and epithelial proliferation. These models are also more closely related to clinical chemical burns than corneal suture models of angiogenesis.We will use alkali burn cornea as a disease model to investigate a novel anti-angiogenic therapy to treat cornea neovascularization and opacity.

تصف هذه الدراسة طريقة للحث على تكوين الأوعية القرنية في عين الفأر عن طريق حرق القلويات. أظهرت الصور التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر التشريح (الشكل 1A ، B) ارتفاعا ملحوظا في درجات الأوعية الدموية الجديدة والعتامة في القرنيات في مجموعة الحروق القلوية (P < 0.05; الشكل 1 ج ، د). تم تلطيخ القرنيات التي تم جمعها في اليوم 10 بشكل أكبر بمضادات CD31 mAb للأوعية الدموية ومضاد LYVE-1 mAb للأوعية الليمفاوية ، على التوالي (الشكل 2A-I). أظهرت مجموعة الحروق القلوية كثافات أعلى بكثير من الأوعية الدموية واللمفاوية بعد 10 أيام (P < 0.001 و P < 0.05 ، على التوالي ؛ الشكل 2J ، K). لوحظ أن سمك القرنية ، كما تم تصويره وقياسه كميا باستخدام OCT (الشكل 3A ، B) ، أعلى بكثير في المجموعة المصابة بحرق قلوي (P < 0.01; الشكل 3 ج).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65289/65289fig01.jpg"> الشكل 1: الأوعية الدموية الجديدة للقرنية الناتجة عن الحرق القلوي والعتامة. (أ، ب) انتشرت الأوعية الدموية القرنية من الأوعية الطرفية باتجاه مركز القرنية في عين الفأر المحترقة القلوية (B) (A) ولكن ليس العين السليمة بعد 10 أيام من الإصابة. (ج، د) القياس الكمي للأوعية الدموية الجديدة للقرنية (C) و (D) العتامة في اللوحتين A و B (± SEM ؛ اختبار t ؛ * P < 0.05 ؛ n = 3 عيون ، 1 عين / فأر). تمثل الأسهم الحمراء الحافة ، ويشير السهم الأصفر إلى الأوعية الجديدة المنبثقة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65289/65289fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65289/65289fig02.jpg"> الشكل 2: الأوعية الدموية الجديدة للقرنية وتكوين الأوعية اللمفاوية الناتجة عن الحرق القلوي. كشفت الكيمياء الهيستولوجية المناعية عن (A ، D ، G) الدم والأوعية الليمفاوية (B ، E ، H) باستخدام مضادات CD31 و anti-LYVE-1 mAbs ، على التوالي. (أ-ج) قرنية الفأر السليمة. (مد-طاء) القرنية المحترقة بالقلويات بعد 10 أيام من الإصابة. (ج، و، ط) صور متراكبة لإشارات CD31 و LYVE-1. (ز-ط) صور مكبرة للوحات D-F. أشرطة المقياس = (A-F) 200 ميكرومتر و (G-I) 500 ميكرومتر. (J ، K) القياس الكمي لكثافة الأوعية الدموية واللمفاوية في الألواح A-F ، كما هو موضح (± SEM ؛ اختبار t ؛ * P < 0.05 ؛ ***P < 0.001 ؛ n = 3 عيون ، 1 عين / فأر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65289/65289fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65289/65289fig03.jpg"> الشكل 3: زيادة سمك القرنية الناتجة عن الحرق القلوي . (أ) صورة OCT لعين فأر سليمة. ب: صورة OCT لقرنية الفأر بعد 10 أيام من الحرق القلوي. (ج) القياس الكمي لسمك القرنية في اللوحتين A و B ، كما تم قياسها في مركز القرنية (± SEM ؛ اختبار t ؛ ** P < 0.01 ؛ n = 3 عيون ، 1 عين / فأر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65289/65289fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Decoding Corneal Neovascularization with Alkali Burn Model for Future Therapeutic Strategies at JoVE.com

يركز هذا البروتوكول على الأوعية الدموية القرنية الجديدة الناجمة عن الحرق القلوي في الفئران. تولد هذه الطريقة نموذجا لأمراض القرنية يمكن استنساخه ويمكن السيطرة عليه لدراسة تكوين الأوعية المرضية والآليات الجزيئية المرتبطة بها واختبار العوامل الدوائية الجديدة لمنع الأوعية الدموية الجديدة للقرنية.

Corneal neovascularization (CoNV), a pathological form of angiogenesis, involves the growth of blood and lymph vessels into the avascular cornea from the ...

نحن نحاول تطوير نموذج قابل للتكرار بدرجة كبيرة لتحفيز الأوعية الدموية الجديدة للقرنية ، وتحديد الطرق النسيجية والمناعية الأكثر صلة لمراقبة العلاجات لمنع وتقليل الأوعية الدموية الجديدة. تتمثل عيوب نماذج حرق القرنية القلوي في صعوبات في التحكم في منطقة وشدة الحرق القلوي ، واختلاف الأوعية الدموية الجديدة للقرنية ، والحرق غير المقصود للحواف والأنسجة بسبب المحلول القلوي الزائد. الأوعية الدموية القرنية هي حالة تهدد الموقع.التسبب في هذه الحالة غير مفهومة بشكل جيد. سيتم استخدام هذا النموذج لاكتساب نظرة ثاقبة جديدة للحالة ، وتحديد الأهداف العلاجية ذات الصلة بالمقارنة مع نموذج تكوين الأوعية الدموية في جيب القرنية ، فإن نماذج الحروق القلوية سهلة الإنشاء نسبيا ، ويمكن استخدامها أيضا لدراسة التهاب القرنية والتليف والانتشار الظهاري. ترتبط هذه النماذج أيضا ارتباطا وثيقا بالحروق الكيميائية السريرية أكثر من نماذج خياطة القرنية لتكوين الأوعية.سنستخدم القرنية القلوية كنموذج للمرض للتحقيق في علاج جديد مضاد لتولد الأوعية لعلاج الأوعية الدموية الجديدة للقرنية والعتامة.

a-mouse-model-for-corneal-neovascularization-by-alkali-burn

Research

JoVE Journal

Biology

A Mouse Model for Corneal Neovascularization by Alkali Burn

1.6K Views.  Baylor College of Medicine. نحن نحاول تطوير نموذج قابل للتكرار بدرجة كبيرة لتحفيز الأوعية الدموية الجديدة للقرنية ، وتحديد الطرق النسيجية والمناعية الأكثر صلة لمراقبة العلاجات لمنع وتقليل الأوعية الدموية الجديدة. تتمثل عيوب نماذج حرق القرنية القلوي في صعوبات في التحكم في منطقة وشدة الحرق القلوي ، ?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: فك تشفير الأوعية الدموية القرنية باستخدام نموذج الحرق القلوي للاستراتيجيات العلاجية المستقبلية 

Corneal neovascularization (CoNV), a pathological form of angiogenesis, involves the growth of blood and lymph vessels into the avascular cornea from the limbus&#160;and adversely&#160;affects transparency and vision. Alkali burn is one of the most common forms of ocular trauma that leads to CoNV. In this protocol, CoNV is experimentally induced using sodium hydroxide solution in a controlled manner to ensure reproducibility. The alkali burn model is useful for understanding the pathology of CoNV and can be extended to study angiogenesis in general because of the avascularity, transparency, and accessibility of the cornea. In this work, CoNV was analyzed by direct examination under a dissecting microscope and by immunostaining flat-mount corneas using anti-CD31 mAb. Lymphangiogenesis was detected on flat-mount corneas by immunostaining using anti-LYVE-1 mAb. Corneal edema was visualized and quantified using optical coherence tomography (OCT). In summary, this model will help to advance existing neovascularization assays and discover new treatment strategies for pathologic ocular and extraocular angiogenesis.

This protocol focuses on alkali burn-induced corneal neovascularization in mice. The method generates a reproducible and controllable corneal disease model to study pathological angiogenesis and the associated molecular mechanisms and to test new pharmacological agents to prevent corneal neovascularization.

Alkali Burn on the Mouse Cornea and OCT Imaging

To begin, inject Meloxicam subcutaneously into the six to eight weeks old C57 Black 6J male mouse 30 minutes before the procedure for pain relief. After anesthetizing the mouse, pinch the toes and confirm the absence of the reflex. Apply one drop of 0.5%proparacaine on the corneal surface of one and a drop of artificial tears on the other eye.Next, using a two millimeter biopsy punch, punch out watman filter paper discs. Add two microliters of one normal sodium hydroxide to a clean Petri dish, and place the filter paper disc on the sodium hydroxide drop, allowing it to soak up for 15 seconds. Using forceps, pick up the filter paper and apply it to the proparacaine treated eye at the center of the cornea for 30 seconds.Wash the eye by flushing with 20 milliliters of sterile saline in a syringe. Wipe the excess saline gently from the eyes and the surrounding area using disposable soft wipes. Place the mouse in a recovery cage on a warm heating pad until ambulatory.On day 10, after the burn, capture OCT images of the anterior segment of the eyes as a volume scan using IR OCT mode with a 30 degree field of view and a 100%IR intensity. The corneal neovascularization sprouted from the limbus vessels toward the corneal center in the alkali burned mouse eye, but not in the healthy eye. The Alkali Burn Group demonstrated significantly elevated neovascularization and opacity scores compared to the control group.Immunostaining of corneas for blood and lymph vessels showed significantly higher densities of blood vessels and lymph vessels after 10 days in the burn group compared to the control group. The thickness of the cornea imaged and quantified using OCT was significantly higher in the burn group.