التمويل: تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (32270538) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2022YFF0710603) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في بكين (6222046) ، والتمويل الاستراتيجي CAS عبر مخطط تمويل CAS-CSIRO (152111KYSB20210011) الممنوح ل G.H.W. مساهمات المؤلف: طور جميع المؤلفين نطاق المراجعة وتركيزها وساهموا في كتابة المخطوطة.

1. تحضيروسط تربيةناسونيا الخالي من الجراثيم 
<ol><li>ضع الشرانق L. sericata المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) على سطح يمكن أن يستوعب جميع الشرانق ، مثل صينية أو ورقة. تخلص من أي يرقات متخلفة أو شرانق قديمة داكنة أو أصداف عذراء فارغة أو نشارة خشب أو شوائب أخرى. احتفظ فقط بالشرانق الصغيرة ذات اللون البني والأحمر وانقلها إلى دورق (حوالي 3000-4000 خادرة). ملاحظة: بعد إجراء العديد من التجارب ، وجد أن الوسط المصنوع من الشرانق القديمة المظلمة تحول بسهولة إلى اللون الداكن وأوقف تطور الدبابير الخالية من الجراثيم. لم تحدث هذه الظاهرة عند استخدام الشرانق الصغيرة ذات اللون البني والأحمر لإنتاج وسط. لا يزال سبب ذلك غير واضح ويتطلب مزيدا من التحقيق للتحقق منه.</li>
	<li>أضف كمية كافية من الماء منزوع الأيونات إلى الكأس الزجاجية لتغطية سطح الشرانق بالكامل. لف فم الدورق بورق القصدير أو الشاش ، وهز الدورق لتنظيف الشوائب على سطح الشرانق ، ثم اسكب الماء. كرر ثلاث إلى خمس مرات.</li>
	<li>ضع الشرانق L. sericata التي تم تنظيفها في خزان المرشح الخاص بمكبس الثوم ، واضغط بقوة ، واجمع سائل الأنسجة في الشرانق L. sericata في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل . ثم ، اسكب تفل الخادرة وضع الشرانق الجديدة في خزان المرشح في مكبس الثوم حتى يتم عصر الجميع. ملاحظة: بالمقارنة مع جهاز بثق الإبرة الذي يستخدمه Wang et al.14 ، فإن مكبس الثوم أكثر ملاءمة ويمكنه فصل السائل الخلالي بشكل أكثر شمولا. يضع هذا التقدم الأساس لإنتاج NRM على نطاق واسع وتخزينه على المدى الطويل.</li>
	<li>يطرد الخليط على حرارة 4 درجات مئوية (25000 × جم) لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي ، سيتم فصل الخليط إلى ثلاث طبقات من الأسفل إلى الأعلى: طبقة الرواسب ، وطبقة البروتين ، وطبقة الدهون (الشكل 1).</li>
	<li>لمنع الانسداد أثناء الترشيح ، قم بشفط طبقة البروتين باستخدام إبرة معقمة 18 جم ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي معقم مخروطي جديد سعة 50 مل من مادة البولي بروبيلين.</li>
	<li>أضف وسط ذبابة الفاكهة السائل التجاري (انظر جدول المواد) إلى مستخلص البروتين بنسبة 1: 1. ملاحظة: تم استخدام L. sericata التجارية الأكثر ملاءمة كمضيف ومواد خام NRM ، مقارنة ب NRMv3. لذلك ، تم تعديل النسبة الغذائية من 1: 2 إلى 1: 1 بناء على NRMv3 ، والتي كانت أكثر ملاءمة لنمو وتطور Nasonia المعقمة (الشكل 2).</li>
	<li>قم بتصفية الوسط المختلط (وسط ذبابة الفاكهة ومستخلص البروتين من L. sericata pupa ) باستخدام نظام ترشيح فراغي بأحجام مسام مختلفة (8 و 1.2 و 0.8 و 0.45 ميكرومتر ؛ انظر جدول المواد) لإزالة الجسيمات ذات الأحجام المختلفة. لمنع الانسداد، قم بتغيير ورق الترشيح عندما يتباطأ التدفق. ملاحظة: يلزم استخدام أنبوب طرد مركزي معقم جديد سعة 50 مل لكل ترشيح.</li>
	<li>قم بطرد السائل مرة أخرى عند 4 درجات مئوية (15000 × جم) لمدة 10 دقائق وتعقيم الوسط الطافي من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. كرر الخطوات المذكورة أعلاه مرة واحدة.</li>
	<li>قم بتخزين وسط الاستزراع عند -20 درجة مئوية بعد الاقتباس (الشكل 3 أ) للتخزين طويل الأجل. ملاحظة: لمنع التلوث والتجميد والذوبان المتكرر ، يوصى بفتح كل أنبوب من NRM مرة واحدة فقط عند استخدام وسط الاستزراع بعد التعبئة (الشكل 3 أ).</li>
</ol>2. جمع البيض الخالي من الجراثيم
<ol><li>لضمان نسبة مستقرة من الذكور إلى الإناث في النسل ، ضع الشرانق في قارورة ذبابة الفاكهة خلال مرحلة العذراء بنسبة 50 أنثى إلى 15 ذكرا بسبب خصائصها الوراثية الأحادية الصيغة الصبغية (يتطور الذكور من خلايا أحادية الصيغة الصبغية ، بينما تتطور الإناث من خلايا ثنائية الصيغة الصبغية ناتجة عن البيض المخصب)4,15.<ol><li>بعد الخروج للبالغين ، اسمح للذكور والإناث بالتزاوج لمدة 1.5 يوم ، ثم ضع حوالي 40 L. sericata pupae في القارورة. في غضون 12-24 ساعة بعد التطفل ، استخدم إبرة تشريح معقمة لفتح أحد طرفي قشرة العذراء بعناية تحت المجهر المجسم (الشكل 4).</li>
		<li>امسك الطرف الآخر باليد وابحث عن أجنة. استخدم إبرة تشريح لنقل الأجنة من سطح نسيج L. sericata pupa إلى مصفاة خلايا معقمة مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)14. ملاحظة: يجب استخدام الشرانق L. sericata القديمة للتطفل لأن أنسجة L. sericata pupa الجافة أسهل في نقل الأجنة . من أجل ضمان النقل السلس للبيض من سطح أنسجة L. sericata pupa ، حاول أن تكون حريصا على عدم ثقب الأنسجة عندما تفتح إبرة التشريح حالة العذراء حتى لا يتدفق السائل الخلالي.</li>
	</ol></li>
	<li>ضع 20-30 جنينا على مصفاة خلوية واغسلها بالتساوي باستخدام 1000 ميكرولتر من محلول هيبوكلوريت الصوديوم التجاري بنسبة 10٪ (انظر جدول المواد) ، متبوعا بغسل آخر ب 1000 ميكرولتر من 1x PBS المعقم. بعد ذلك ، اغسل مرة واحدة باستخدام 1000 ميكرولتر من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ واغسله ثلاث مرات باستخدام 1000 ميكرولتر من 1x PBS المعقم.</li>
	<li>أولا ، ضع ورقة شبكية من مادة البولي بروبيلين بقطر 5 مم (انظر جدول المواد) تم ترطيبها مسبقا باستخدام 1x PBS في لوحة 24 بئرا. ثم ، باستخدام فرشاة صغيرة معقمة ، قم بتنظيف أجنة برفق على مصفاة الخلية على ورقة شبكة البولي بروبلين. يمكن القيام بذلك لجميع الآبار الأربعة في عمود عمودي من لوحة 24 بئرا.</li>
</ol>3. تربية الدبابير الخالية من الجراثيم
<ol><li>أضف 50 ميكرولتر من NRM إلى كل بئر في غطاء التدفق الصفحي. للحفاظ على بيئة رطبة للنمو ، أضف 1 مل من الماء المعقم بين كل بئر في لوحة 24 بئرا. يمكن أيضا وضع دورق صغير يحتوي على 30 مل من الماء المعقم في صندوق بلاستيكي معقم سعة 5 لتر مع لوحة 24 بئرا.<ol><li>طوال التجربة بأكملها ، احتفظ بالصندوق البلاستيكي المعقم واللوحة المكونة من 24 بئرا في غرفة المناخ عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 25 ± 2 درجة مئوية وتحت ضوء ثابت.</li>
	</ol></li>
	<li>قبل نقل وإضافة NRM كل يوم ، قم بإذابة NRM المجمد على مقعد التدفق الرقائقي. في بيئة معقمة ، استخدم ملاقط مطهرة بالكحول لنقل شبكة البولي بروبلين مع اليرقات عليها من بئر إلى آخر. أخيرا ، أضف 50 ميكرولتر من NRM التي تمت موازنتها لدرجة حرارة الغرفة (الشكل 3B). كرر العمليات المذكورة أعلاه كل يوم حتى يتم ملاحظة الشرانق. ملاحظة: مع تطور الدبابير ، يجب زيادة كمية NRM بشكل مناسب لضمان حصول الدبابير الخالية من الجراثيم على تغذية كافية. على سبيل المثال ، تم تزويد اليرقات الداخلية الرابعة ب 60 إلى 70 ميكرولتر من NRM. نظرا لأن مراحل النمو المختلفة قد تتعايش في نفس البئر ، استخدم فرشاة معقمة لنقل الشرانق. أضف كمية صغيرة من NRM إلى اليرقات المتبقية. استخدم تقنيات معقمة لتجنب غزو الميكروبات والتلوث.</li>
	<li>بعد الرضاعة لمدة 9 إلى 11 يوما ، يتطور أكثر من 80٪ من اليرقات إلى خادرة بيضاء أو صفراء. في هذا الوقت ، انقل الفلتر إلى لوحة بئر نظيفة وتوقف عن إضافة وسيط استزراع لانتظار الإغلاق.</li>
</ol>

تربية دبابير ناسونيا الخالية من الجراثيم

<ol>
	<li>Diviccaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+impact+of+the+microbiome+on+neuroactive+steroid+levels+in+germ-free+animals.">Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551 (2021).</li><li>Pang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-species+transplantation+of+gut+microbiota+from+human+to+pigs.">Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs.</a> The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).</li><li>Uzbay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-free+animal+experiments+in+the+gut+microbiota+studies.">Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies.</a> Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).</li><li>Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasonia-microbiome+associations:+a+model+for+evolutionary+hologenomics+research.">Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research.</a> Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).</li><li>Li, J., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+efficient+germ-free+animal+system+to+support+functional+microbiome+research.">Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research.</a> Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).</li><li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+microbiome+confer+multigenerational+host+resistance+after+sub-toxic+pesticide+exposure.">Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure.</a> Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).</li><li>Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coadaptation+between+host+genome+and+microbiome+under+long-term+xenobiotic-induced+selection.">Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li><li>Dittmer, J., Brucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+your+host+shuts+down:+larval+diapause+impacts+host-microbiome+interactions+in+Nasonia+vitripennis.">When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis.</a> Microbiome. 9 (1), 85 (2021).</li><li>Dittmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+a+holobiont-recent+advances+and+perspectives+in+Nasonia+wasps.">Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1478 (2016).</li><li>Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylosymbiosis:+relationships+and+functional+effects+of+microbial+communities+across+host+evolutionary+history.">Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history.</a> PLoS Biology. 14 (11), e2000225 (2016).</li><li>Heavner, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+venom+gland+transcriptome+of+a+Drosophila+parasitoid+wasp,+Leptopilina+heterotoma,+reveals+novel+and+shared+bioactive+profiles+with+stinging+Hymenoptera.">Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera.</a> Gene. 526 (2), 195-204 (2013).</li><li>Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+the+hymenoptera+genetic+model,+Nasonia.">In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia.</a> PLoS One. 7 (12), e51269 (2012).</li><li>Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+approach+to+germ-free+rearing+in+the+jewel+wasp+Nasonia.">An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia.</a> PeerJ. 4, e2316 (2016).</li><li>Wang, G. H., Brucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+Nasonia+germ-free+rearing.">An optimized method for Nasonia germ-free rearing.</a> Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).</li><li>Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hologenomic+basis+of+speciation:+gut+bacteria+cause+hybrid+lethality+in+the+genus+Nasonia.">The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia.</a> Science. 341 (6146), 667-669 (2013).</li><li>Fontaine, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+free+of+germs+is+germ-free?+Detection+of+bacterial+contamination+in+a+germ+free+mouse+unit.">How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit.</a> Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).</li><li>Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunomodulatory+molecule+of+symbiotic+bacteria+directs+maturation+of+the+host+immune+system.">An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system.</a> Cell. 122 (1), 107-118 (2005).</li><li>Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+drugs+and+the+gut+microbiome.">Interaction between drugs and the gut microbiome.</a> Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

مع تطبيق تقنيات الكشف عالية الإنتاجية مثل علم الجينوم والأيض ، أدرك الباحثون تدريجيا أن هناك تنوعا وراثيا هائلا وتعقيدا أيضيا في ميكروبيوتا الأمعاء16. ترتبط هذه البكتيريا التكافلية ارتباطا وثيقا بحالات فسيولوجية أو مرضية مختلفة ، مثل التمثيل الغذائي الغذائي للمضيف ، والأور?...

الحيوانات الخالية من الجراثيم هي لا تحتوي على كائنات حية حية وطفيليات يمكن اكتشافها1. يمكن الحصول على أجنة خالية من الجراثيم عن طريق تشريح الأم في ظل ظروف معقمة ثم تربيتها لاحقا في أنظمة الحاجز2. يمكن استخدام هذه الحيوانات لدراسة آثار الكائنات الحية الدقيقة على الحيوانات ، مثل الجراثيم المعوية ، والجهاز المناعي ، والتمثيل الغذائي1. مع بعض الوسائل التقنية ، يمكن جعل العديد من الحشرات وحتى الثدييات معقمة 3,4. تلعب الحيوانات الخالية من الجراثيم دورا فريدا وقد استخدمت على نطاق واسع في جوانب مختلفة من أبحاث علم الأحياء الدقيقة5. على سبيل المثال ، كشف استخدام دبابير Nasonia الخالية من الجراثيم أن الكائنات الحية الدقيقة يمكن أن تساعد المضيفين على التكيف مع البيئات الجديدة تحت الضغط البيئي الخارجي طويل الأجل 6,7.
طفيليات Nasonia هي دبابير طفيلية صغيرة تحقن بيضها في شرانق الذباب4. هناك أربعة أنواع معروفة من ناسونيا ، بما في ذلك Nasonia vitripennis و Nasonia longicornis و Nasonia giraulti و Nasonia oneida8. يمكن العثور على N. vitripennis في جميع أنحاء العالم ، في حين أن الأنواع الثلاثة الأخرى لها نطاقات محدودة في أمريكا الشمالية4. تعتبر الدبابير الطفيلية Nasonia حشرات نموذجية مثالية بسبب خصائصها ، مثل سهولة الزراعة ، ودورة التكاثر القصيرة ، والجينوم المتسلسل ، و diapause طويل المدى 8,9. يمكن استخدامها لدراسة جوانب مختلفة من تطور الحشرات ، وعلم الوراثة ، والتنمية ، والسلوك ، والتكافل10. علاوة على ذلك ، يمكن أن تساعد الدبابير الطفيلية Nasonia أيضا في السيطرة على الذباب الضار في الزراعة والأمراض11. يتضمن الإنشاء الناجح لنظام الحشرات العقيمة خطوتين رئيسيتين: (1) تعقيم الأجنة و (2) توفير الغذاء المعقم لليرقات في المختبر. من أجل الحصول على طعام معقم ، طور Brucker and Bordenstein 12 وسط تربية Nasonia (NRMv1) في عام 2012 باستخدام مواد كيميائية مثل المضادات الحيوية والمبيض ومصل الجنين البقري لقتل البكتيريا12. ومع ذلك ، أدت طريقة التعقيم الكيميائي إلى انخفاض معدلات البقاء على قيد الحياة و eclosion من N. vitripennis13. ثم ، في عام 2016 ، شروبشاير وآخرون طور NRMv2 باستخدام طريقة تعقيم المرشح بدلا من طريقة التعقيم الكيميائي للقضاء على مخاطر المضادات الحيوية والمواد الأخرى ، وتحسين عملية التكاثر13. لسوء الحظ ، لا تزال هذه الطريقة لها بعض العيوب ، مثل التحديات المرتبطة بإعداد واستخدام الوسط ، فضلا عن مخاطر الغرق أو نقص التغذية أو الجفاف للأجنة واليرقات والشرانق المغلقة14. قام وانغ وبروكر14 مؤخرا بتحسين وسائط تربية ناسونيا الإصدار 3 (NRMv3) وبروتوكولات الإصدار 2 من التربية الخالية من الجراثيم (GFRv2). خفضت هذه التحسينات التكلفة واستهلاك الوسائط. ومع ذلك ، فإن NRMv3 لديه وقت تخزين قصير جدا وهو شديد التأثر بالتلوث.
بناء على NRMv3 ، تم تحسين طريقة تخزين أداة تحضير NRM ونسبة المغذيات في هذه الدراسة. يسهل هذا التحسين المنهجي استخدام N. vitripennis كنموذج لدراسات الميكروبيوم. بالمقارنة مع NRMv3 الذي طوره Wang et al.14 ، فإن الأداة المحسنة للضغط على Sarcophaga bullata pupa ، إحدى المواد الخام NRM ، تعزز بشكل كبير كفاءة إنتاج سائل الأنسجة S. bullata pupa مقارنة بحقنة 60 مل مع ثقب سفلي يستخدمه Wang et al.14. قمنا بتعديل نسبة المغذيات من NRM ، مما أدى إلى زيادة معينة في معدل بقاء دبابير Nasonia الخالية من الجراثيم دون التأثير على وقت نموها. بالإضافة إلى ذلك ، تم تعبئة NRM في أنابيب طرد مركزي ذات سعة صغيرة (1.5 مل) وتجميدها في ثلاجة -20 درجة مئوية لتمديد وقت التخزين. تجدر الإشارة إلى أنه بينما استخدمنا الذبابة المنزلية Lucilia sericata كمضيف ومصدر لإعداد NRM ، فمن المحتمل أن يتم تكييف هذا البروتوكول مع مضيفات Nasonia الأخرى المتوفرة في المختبر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 Sterile vacuum filter</td>
			<td>NEST</td>
			<td>331011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SodiumHypochlorite</td>
			<td>LIRCON</td>
			<td>XB-84BS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mesh nylon net</td>
			<td>BIOBYING</td>
			<td>BY-378Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24&#160;well-plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>702001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8, 1.2, 0.8, and 0.45 &#181;m filters</td>
			<td>Shanghai Xingya Purification Material Factory</td>
			<td>HN-AA-JT-10079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethyl alcohol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>E809057-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>BIOLOGIX</td>
			<td>15-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Drosophila Medium</td>
			<td>Boer</td>
			<td>B645446-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Bioroyee</td>
			<td>17-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garlic press</td>
			<td>Taobao</td>
			<td>No Catalog numbers</td>
			<td>Purchase on Taobao</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucillia sericata pupae</td>
			<td>Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>No Catalog numbers</td>
			<td>Purchase on Taobao</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small writing brush</td>
			<td>Cestidur</td>
			<td>BL0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>SOPTOP</td>
			<td>RX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>SALMART</td>
			<td>A109001-56</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the rearing procedure of germ-free wasps

تكنولوجيا التربية المعقمة هي طريقة لاستزراع الحشرات في ظل ظروف معقمة أو شبه معقمة ، والتي يمكن أن تقضي بشكل فعال على تأثير الكائنات الحية الدقيقة الخارجية على ميكروبات الحشرات وبالتالي تعزيز التطور السريع لأبحاث ميكروبات الحشرات. Nasonia (جنس الدبور) هي حشرة دبور طفيلية لها العديد من المزايا ، مثل العمر القصير ، والتباين الجيني العالي ، وسهولة التشغيل ، وما إلى ذلك ، وتستخدم على نطاق واسع كنظام نموذج للحشرات. على عكس العلاج بالمضادات الحيوية ، الذي يمكن أن يقلل فقط من عدد الكائنات الحية الدقيقة في الحيوانات ، يمكن لتقنيات التربية المعقمة التحكم في تكوين وكمية الكائنات الحية الدقيقة في الحيوانات ، مما يسهل دراسة تفاعلات المضيف والميكروب. ومع ذلك ، فإن الإصدارات السابقة من وسط تربية Nasonia (NRM) بها بعض العيوب والمشاكل ، مثل عملية التحضير المعقدة والمستهلكة للوقت ، والتلوث السهل بالبكتيريا أو الفطريات ، ووقت التخزين القصير. لذلك ، تحل هذه الدراسة هذه المشكلات من خلال تحسين الأدوات المستخدمة في عملية إعداد NRM وظروف التخزين ونسب المكونات. يمكن أن يسمح الوسط الأمثل بالتخزين عند -20 درجة مئوية لمدة 3 أشهر على الأقل والقضاء على إمكانية تلوث NRM أثناء تغذية الدبابير المعقمة. هذا يحسن معدل البقاء على قيد الحياة والمستوى الصحي ل Nasonia المعقم ، وهو أمر مهم لاستخدام Nasonia كنموذج للبحوث الميكروبية.

Germ-free animals are animals that have no detectable living microorganisms and parasites1. Germ-free embryos can be obtained by dissecting the mother under aseptic conditions and subsequently raised in barrier systems2. Such animals can be used to study the effects of microorganisms on animals, such as on the intestinal microbiota, immune system, and metabolism1. With certain technical means, many insects and even mammals can be rendered sterile3,4. Germ-free animals have a unique role and have been widely used in various aspects of microbiology research5. For example, the use of germ-free Nasonia wasps has revealed that microorganisms can help hosts adapt to new environments under long-term exogenous environmental stress6,7.
Nasonia parasitoids are small parasitic wasps that inject their eggs into the pupae of flies4. There are four known species of Nasonia, including Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti, and Nasonia oneida8. N. vitripennis can be found worldwide, while the other three species have limited ranges in North America4. Nasonia parasitoid wasps are regarded as ideal model insects because of their characteristics, such as easy cultivation, short reproduction cycle, sequenced genome, and long term diapause8,9. They can be used to study various aspects of insect evolution, genetics, development, behavior, and symbiosis10. Moreover, Nasonia parasitoid wasps can also help control harmful flies in agriculture and disease11. The successful establishment of a sterile insect system involves two major steps: (1) sterilization of the embryos and (2) provision of sterile food to the larvae in vitro. In order to obtain sterile food, Brucker and Bordenstein12 developed Nasonia rearing medium (NRMv1) in 2012 by using chemicals such as antibiotics, bleach, and fetal bovine serum to kill bacteria12. However, the chemical sterilization method resulted in low survival and eclosion rates of N. vitripennis13. Then, in 2016, Shropshire et al. developed NRMv2 by using a filter sterilization method instead of a chemical sterilization method to eliminate the hazards of antibiotics and other substances, and optimized the breeding process13. Unfortunately, this method still has some disadvantages, such as the challenges associated with preparing and using the medium, as well as the risks of drowning, underfeeding, or dehydration for the embryos, larvae, and closed pupae14. Wang and Brucker14 recently improved the Nasonia rearing media version 3 (NRMv3) and the germ-free rearing version 2 (GFRv2) protocols. These improvements reduced the cost and media consumption. However, the NRMv3 has a very short storage time and is highly susceptible to contamination.
Building on NRMv3, the NRM preparation tool storage method and nutrient ratio were optimized in this study. This methodological refinement facilitates using N. vitripennis as a model for microbiome studies. Compared with the NRMv3 developed by Wang et al.14, the improved tool for squeezing Sarcophaga bullata pupa, one of the NRM raw materials, greatly enhances the production efficiency of S. bullata pupa tissue fluid compared with the 60 mL syringe with a bottom hole used by Wang et al.14. We adjusted the nutrient ratio of NRM, which led to a certain increase in the survival rate of germ-free Nasonia wasps without affecting their development time. In addition, the NRM was packed into small-capacity centrifuge tubes (1.5 mL) and frozen in a -20 &#176;C refrigerator to extend the storage time. It is worth noting that while we used the housefly Lucilia sericata as the host and source for NRM preparation, this protocol can likely be adapted for other Nasonia hosts that are available in the laboratory.

تسليط الضوء على المؤلف: تحسين إجراء تربية الدبابير الخالية من الجراثيم  

تحسين عملية تربية الدبابير الخالية من الجراثيم

Our research focuses on the study of insect-microbiota interactions, specifically investigating the impact of in those symbiotic bacteria and exploring the dynamics of host-microbe relationships. Germ-free Nasonia is an essential tool for conducting this research. Current research utilize technologies such as high-throughput sequencing, germ-free insect rearing, transcriptoptomics, proteomics, and advanced microscope.This tool enable comprehensive analysis and virtualization of insect-microbe host interaction for advancing our understanding of this field. The optimized the procedure for preparing the Nasonia Rearing Medium provides economic advantages and saves time and effort. Additionally, it effectively reduces the risk of NRM contamination during the feeding process, greatly improving the efficiency of producing aseptic Nasonia

تم تحسين كفاءة إعداد NRM بشكل كبير من خلال تحسين أدوات التحضير. بالإضافة إلى ذلك ، تم القضاء على مشكلة تلوث NRM في عملية التغذية من خلال تحسين الاستراتيجية وطريقة الحفظ. في الوقت نفسه ، كان لدى NRM المعدل نسبة غذائية أكثر ملاءمة لنمو وتطور الدبابير الخالية من الجراثيم مع L. sericata كمضيفين. تحس...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Rearing Procedure of Germ-Free Wasps at JoVE.com

تم تشريح أجنة دبور ناسونيا من الشرانق Lucillia sericata بعد التطفل لمدة 12-24 ساعة وغسلها بالكحول ومحلول هيبوكلوريت الصوديوم 10٪ للحصول على أجنة خالية من الجراثيم. بعد تربية الأجنة الخالية من الجراثيم وتزويدها بوسط تربية Nasonia للنمو والتطور في المختبر ، تم الحصول على Nasonia البالغين الخالية من الجراثيم.

Aseptic rearing technology is a method of culturing insects under sterile or almost sterile conditions, which can effectively eliminate the influence of ...

يركز بحثنا على دراسة تفاعلات الحشرات والميكروبات ، وتحديدا التحقيق في تأثير تلك البكتيريا التكافلية واستكشاف ديناميكيات العلاقات بين المضيف والميكروب. Nasonia الخالية من الجراثيم هي أداة أساسية لإجراء هذا البحث. تستخدم الأبحاث الحالية تقنيات مثل التسلسل عالي الإنتاجية ، وتربية الحشرات الخالية من الجراثيم ، وعلم البصريات النسخية ، والبروتينات ، والمجهر المتقدم.تتيح هذه الأداة التحليل الشامل والمحاكاة الافتراضية للتفاعل بين مضيف الحشرات والميكروب لتعزيز فهمنا لهذا المجال. يوفر الإجراء الأمثل لإعداد وسط تربية Nasonia مزايا اقتصادية ويوفر الوقت والجهد. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يقلل بشكل فعال من خطر تلوث NRM أثناء عملية التغذية ، مما يحسن بشكل كبير من كفاءة إنتاج Nasonia المعقمة

optimizing-the-rearing-procedure-of-germ-free-wasps

Research

JoVE Journal

Biology

Optimizing the Rearing Procedure of Germ-Free Wasps

1.3K Views.  Chinese Academy of Sciences. يركز بحثنا على دراسة تفاعلات الحشرات والميكروبات ، وتحديدا التحقيق في تأثير تلك البكتيريا التكافلية واستكشاف ديناميكيات العلاقات بين المضيف والميكروب. Nasonia الخالية من الجراثيم هي أداة أساسية لإجراء هذا البحث. تستخدم الأبحاث الحالية تقنيات مثل التسلسل عالي الإنتاجية ، وت...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تحسين إجراء تربية الدبابير الخالية من الجراثيم  

Aseptic rearing technology is a method of culturing insects under sterile or almost sterile conditions, which can effectively eliminate the influence of external microorganisms on insect microbiota and thus promote the rapid development of insect microbiota research. Nasonia (wasp genus) is a parasitic wasp insect that has many advantages, such as a short lifespan, high genetic variation, easy operation, etc., and is widely used as an insect model system. Unlike antibiotic treatment, which can only reduce the number of microorganisms in animals, aseptic rearing techniques can control both the composition and quantity of microorganisms in animals, further facilitating the study of host-microbe interactions. However, previous versions of Nasonia rearing medium (NRM) have some defects and problems, such as a complex and time-consuming preparation process, easy contamination by bacteria or fungi, and short storage time. Therefore, this study solves these problems by optimizing the tools used in the NRM preparation process, storage conditions, and component ratios. The optimized medium could allow storage at -20 &#176;C for at least 3 months and eliminate the possibility of NRM contamination during feeding sterile wasps. This further improves the survival rate and health level of aseptic Nasonia, which is important for using Nasonia as a model for microbial research.

Nasonia wasp embryos were dissected from Lucillia sericata pupae after parasitization for 12-24 h and washed with alcohol and 10% sodium hypochlorite solution to obtain germ-free embryos. After rearing the germ-free embryos&#160;and supplying them with Nasonia rearing medium to grow and develop in vitro, germ-free Nasonia adults were obtained.

Preparation of Germ-Free Nasonia Rearing Medium (NRM)

Preparation of Germ-Free Nasonia Rearing Medium (NRM)  

To begin, place commercially available Lucillia sericata pupae on a sheet of paper. Discard any underdeveloped larvae, dark old pupae, empty pupil shells, sawdust, or other impurities. Transfer young brownish red colored pupae to a beaker and immerse the pupae in deionized water.Wrap the beaker with tinfoil or gauze and shake it to clean any surface impurities off the pupae. Then discard the water. Place the cleaned pupae in the filter tank of a garlic press, and squeeze hard.Then collect the pupae tissue fluid in a 50-millimeter sterile centrifuge tube, and centrifuge it at 25, 000 x g for 10 minutes at four degrees Celsius. Using a 22-gauge sterile needle, collect the protein layer into a new 50-millimeter polypropylene centrifuge tube, and add commercial liquid drosophila medium at an equal ratio to the protein extract. To remove the particles of different sizes from the mixture, filter it using a vacuum filtration system with filter paper of different pore sizes.To prevent clogging change the filter paper when the flow slows down. Once the filtrate is centrifuged, sterilize the supernatant through a 0.22 micrometer syringe filter, and store the prepared nasonia rearing medium, or NRM aliquots, at 20 degrees Celsius until further use.

تحضير وسط تربية ناسونيا الخالي من الجراثيم (NRM)

Germ-Free Wasp Embryo Collection and Rearing with Nasonia-Rearing Medium (NRM)

Germ-Free Wasp Embryo Collection and Rearing with Nasonia-Rearing Medium (NRM)  

To begin, parasitize about 40 Lucilia sericata pupae onto emerging adult male and female Nasonia wasps mated for 1.5 days. Within 12 to 24 hours after parasitization, carefully open one end of the pupal shell using a sterile dissecting needle. Hold the other end of the shell and locate the wasp embryo.Then transfer the embryo to a sterile cell strainer moistened with PBS. Once 20 to 30 embryos have been transferred, wash them with 1, 000 microliters of 10%sodium hypochlorite solution followed by sterile PBS and 70%ethanol. Finally, wash them three times with sterile PBS.Next, place a polypropylene mesh sheet pre-wetted with PBS into a 24 well plate. Using a sterilized small brush, gently transfer the wasp embryos from the cell strainer to the polypropylene mesh sheet. For the wasp rearing, add 50 microliters of prepared NRM to each well with a sheet.Then add one milliliter of sterile water between each well to maintain a humid environment for growth. The next day, transfer the polypropylene mesh containing the larva from one well to another well using alcohol disinfected tweezers, and add 50 microliters of equilibrated NRM. After nine to 11 days of feeding, over 80%of the larva should develop into white or yellow pupae.then transfer the mesh to a clean well plate. In the present study, the survival rate of the germ-free wasps from larva to pupae was significantly improved compared to rearing germ-free wasps with NRM version three. Additionally, there was no difference in the generation period between the germ-free and conventionally reared wasps.