자금 지원: 이 작업은 중국 국립 과학 재단(32270538), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2022YFF0710603), 베이징 자연 과학 재단(6222046) 및 CAS-CSIRO 자금 지원 계획(152111KYSB20210011)을 통한 CAS 전략적 자금 지원으로 GHW에 수여되었습니다. 저자 기여: 모든 저자는 검토의 범위와 초점을 개발하고 원고 작성에 기여했습니다.

1. 무균 나소니아 사육배지 제조
<ol><li>시중에서 판매되는 L. sericata 번데기( 재료 표 참조)를 쟁반이나 종이와 같이 모든 번데기를 수용할 수 있는 표면에 놓습니다. 발육이 저조한 유충, 짙은 늙은 번데기, 빈 번데기 껍질, 톱밥 또는 기타 불순물은 버리십시오. 갈색을 띤 붉은 색의 어린 번데기 만 보관하고 비커 (약 3,000-4,000 마리의 번데기)로 옮깁니다. 참고: 많은 실험을 수행한 후 어두운 오래된 번데기로 만든 배지가 쉽게 어두워지고 무균 말벌의 발달을 멈추는 것으로 나타났습니다. 이 현상은 어린 갈색-적색 번데기를 사용하여 배지를 생산할 때 발생하지 않았습니다. 그 이유는 아직 불분명하며 이를 확인하기 위해 추가 조사가 필요합니다.</li>
	<li>번데기의 전체 표면을 덮을 수 있도록 비커에 충분한 탈이온수를 추가합니다. 비커의 입을 은박지나 거즈로 감싸고 비커를 흔들어 번데기 표면의 불순물을 닦은 다음 물을 붓습니다. 3-5 번 반복하십시오.</li>
	<li>세척한 L. sericata 번데기를 마늘 프레스의 필터 탱크에 넣고 세게 짜낸 다음 L. sericata 번데기의 조직액을 50mL 멸균 원심분리기 튜브에 수집합니다. 그런 다음 번데기 찌꺼기를 붓고 마늘 프레스의 필터 탱크에 새 번데기를 모두 짜낼 때까지 넣습니다. 참고: Wang et al.14에서 사용한 바늘 압출 장치에 비해 마늘 프레스가 더 편리하고 간질액을 더 철저하게 분리할 수 있습니다. 이러한 발전은 NRM의 대규모 생산 및 장기 보관을 위한 토대를 마련합니다.</li>
	<li>혼합물을 4°C(25,000 x g)에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 혼합물은 침전물층, 단백질층, 지방층의 세 층으로 아래에서 위로 분리됩니다(그림 1).</li>
	<li>여과 중 막힘을 방지하려면 18G 멸균 바늘을 사용하여 단백질 층을 흡인하고 새로운 50mL 원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>상업용 액체 초파리 배지( 재료 표 참조)를 단백질 추출물에 1:1 비율로 추가합니다. 참고: NRMv3에 비해 더 편리한 상용화된 L. serichata 가 호스트 및 NRM 원료로 사용되었습니다. 따라서 영양 비율은 NRMv3를 기준으로 1:2에서 1:1로 조정되었으며, 이는 멸균 Nasonia 의 성장 및 발달에 더 적합했습니다(그림 2).</li>
	<li>다양한 공극 크기(8, 1.2, 0.8 및 0.45μm, 재료 표 참조)를 가진 진공 여과 시스템을 사용하여 혼합 배지(초파리 배지 및 L. sericata pupa의 단백질 추출물)를 여과하여 다양한 크기의 입자를 제거합니다. 막힘을 방지하려면 흐름이 느려질 때 여과지를 교체하십시오. 알림: 각 여과에는 새 50mL 멸균 원심분리기 튜브를 사용해야 합니다.</li>
	<li>액체를 다시 4°C(15,000 x g)에서 10분 동안 원심분리하고 0.22μm 주사기 필터를 통해 상등액 배지를 멸균합니다. 위의 단계를 한 번 반복합니다.</li>
	<li>장기 보관을 위해 분취 후 배양 배지를 -20°C에서 보관(그림 3A). 알림: 오염과 반복적인 동결 및 해동을 방지하기 위해 포장 후 배양 배지를 사용할 때 NRM의 각 튜브를 한 번만 여는 것이 좋습니다(그림 3A).</li>
</ol>2. 무균 계란 수집
<ol><li>자손의 안정적인 수컷 대 암컷 비율을 보장하기 위해 번데기 단계에서 번데기를 반수체 유전적 특성 때문에 암컷 50마리 대 수컷 15마리의 비율로 초파리 바이알에 넣습니다(수컷은 반수체 세포에서 발달하고 암컷은 수정란에서 유래한 이배체 세포에서 발달함)4,15.<ol><li>성충이 된 후 수컷과 암컷이 1.5일 동안 짝짓기를 하도록 한 다음 약 40L. 세리카타 번데기를 바이알에 넣습니다. 기생 후 12-24시간 이내에 멸균 해부 바늘을 사용하여 실체 현미경으로 번데기 껍질의 한쪽 끝을 조심스럽게 엽니다(그림 4).</li>
		<li>다른 쪽 끝을 손으로 잡고 말벌 배아를 찾으십시오. 해부 바늘을 사용하여 L. sericata 번데기 조직 표면에서 인산염 완충 식염수(PBS)가 있는 멸균 세포 여과기로 배아를 옮깁니다14. 참고: 오래된 L. sericata 번데기는 건조한 L. sericata 번데기 조직이 배아를 이식하기 쉽기 때문에 기생에 사용해야 합니다. L. sericata 번데기 조직 표면에서 알을 원활하게 옮기기 위해 해부 바늘이 번데기 케이스를 열 때 조직에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하여 간질액이 흘러나오지 않도록 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>20-30개의 배아를 세포 여과기에 놓고 1,000μL의 10% 상업용 차아염소산나트륨 용액( 재료 표 참조)으로 고르게 세척한 다음 1,000μL의 1x 멸균 PBS로 다시 세척합니다. 그런 다음 1,000 μL의 70% 에탄올 용액으로 한 번 세척하고 1,000 μL의 1x 멸균 PBS로 세 번 세척합니다.</li>
	<li>먼저, 1x PBS로 미리 습윤된 5mm 직경의 폴리프로필렌 메쉬 시트( 재료 표 참조)를 24웰 플레이트에 넣습니다. 그런 다음 멸균 된 작은 브러시를 사용하여 세포 여과기의 말벌 배아를 폴리 프로필렌 메쉬 시트에 부드럽게 브러시로 닦습니다. 이는 24-웰 플레이트의 수직 컬럼 내의 4개의 웰 모두에 대해 수행될 수 있다.</li>
</ol>3. 무균 말벌 사육
<ol><li>층류 후드의 각 웰에 50μL의 NRM을 추가합니다. 성장을 위한 습한 환경을 유지하려면 24웰 플레이트의 각 웰 사이에 1mL의 멸균수를 추가합니다. 30mL의 멸균수가 들어 있는 작은 비커를 24웰 플레이트와 함께 5L 멸균 플라스틱 상자에 넣을 수도 있습니다.<ol><li>전체 실험에 걸쳐, 멸균 플라스틱 상자 및 24-웰 플레이트를 25 ± 2°C의 일정한 온도 및 일정한 빛 하에 기후 챔버에 보관한다.</li>
	</ol></li>
	<li>매일 NRM을 옮기고 추가하기 전에 층류 벤치에서 냉동 NRM을 해동하십시오. 무균 환경에서 알코올 소독 핀셋을 사용하여 유충이있는 폴리 프로필렌 메쉬를 한 우물에서 다른 우물로 옮깁니다. 마지막으로 실온에서 평형을 이룬 NRM 50μL를 추가합니다(그림 3B). 번데기가 관찰 될 때까지 매일 위의 작업을 반복하십시오. 알림: 말벌의 발달과 함께 무균 말벌이 충분한 영양을 섭취할 수 있도록 NRM의 양을 적절하게 늘려야 합니다. 예를 들어, 네 번째 instar 유충에는 60 내지 70 μL의 NRM이 공급되었습니다. 같은 우물에 다른 발달 단계가 공존 할 수 있으므로 멸균 된 브러시를 사용하여 번데기를 옮깁니다. 나머지 유충에 소량의 NRM을 첨가하십시오. 미생물 침입 및 오염을 피하기 위해 무균 기술을 사용하십시오.</li>
	<li>9-11 일 동안 먹이를 먹은 후 유충의 80 % 이상이 흰색 또는 노란색 번데기로 발전합니다. 이때, 필터를 깨끗한 웰 플레이트로 옮기고 배양액 첨가를 중단하여 이클로전을 기다린다.</li>
</ol>

무균 Nasonia 말벌 사육

<ol>
	<li>Diviccaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+impact+of+the+microbiome+on+neuroactive+steroid+levels+in+germ-free+animals.">Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551 (2021).</li><li>Pang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-species+transplantation+of+gut+microbiota+from+human+to+pigs.">Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs.</a> The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).</li><li>Uzbay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-free+animal+experiments+in+the+gut+microbiota+studies.">Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies.</a> Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).</li><li>Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasonia-microbiome+associations:+a+model+for+evolutionary+hologenomics+research.">Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research.</a> Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).</li><li>Li, J., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+efficient+germ-free+animal+system+to+support+functional+microbiome+research.">Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research.</a> Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).</li><li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+microbiome+confer+multigenerational+host+resistance+after+sub-toxic+pesticide+exposure.">Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure.</a> Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).</li><li>Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coadaptation+between+host+genome+and+microbiome+under+long-term+xenobiotic-induced+selection.">Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li><li>Dittmer, J., Brucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+your+host+shuts+down:+larval+diapause+impacts+host-microbiome+interactions+in+Nasonia+vitripennis.">When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis.</a> Microbiome. 9 (1), 85 (2021).</li><li>Dittmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+a+holobiont-recent+advances+and+perspectives+in+Nasonia+wasps.">Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1478 (2016).</li><li>Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylosymbiosis:+relationships+and+functional+effects+of+microbial+communities+across+host+evolutionary+history.">Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history.</a> PLoS Biology. 14 (11), e2000225 (2016).</li><li>Heavner, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+venom+gland+transcriptome+of+a+Drosophila+parasitoid+wasp,+Leptopilina+heterotoma,+reveals+novel+and+shared+bioactive+profiles+with+stinging+Hymenoptera.">Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera.</a> Gene. 526 (2), 195-204 (2013).</li><li>Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+the+hymenoptera+genetic+model,+Nasonia.">In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia.</a> PLoS One. 7 (12), e51269 (2012).</li><li>Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+approach+to+germ-free+rearing+in+the+jewel+wasp+Nasonia.">An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia.</a> PeerJ. 4, e2316 (2016).</li><li>Wang, G. H., Brucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+Nasonia+germ-free+rearing.">An optimized method for Nasonia germ-free rearing.</a> Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).</li><li>Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hologenomic+basis+of+speciation:+gut+bacteria+cause+hybrid+lethality+in+the+genus+Nasonia.">The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia.</a> Science. 341 (6146), 667-669 (2013).</li><li>Fontaine, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+free+of+germs+is+germ-free?+Detection+of+bacterial+contamination+in+a+germ+free+mouse+unit.">How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit.</a> Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).</li><li>Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunomodulatory+molecule+of+symbiotic+bacteria+directs+maturation+of+the+host+immune+system.">An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system.</a> Cell. 122 (1), 107-118 (2005).</li><li>Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+drugs+and+the+gut+microbiome.">Interaction between drugs and the gut microbiome.</a> Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).</li></ol>

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유전체학(genomics) 및 대사체학(metabolomics)과 같은 고처리량 검출 기술을 적용하면서 연구자들은 장내 미생물군에 엄청난 유전적 다양성과 대사 복잡성이 존재한다는 사실을 점차 깨닫게 되었다16. 이러한 공생 박테리아는 숙주와의 복잡한 상호작용을 통해 숙주의 영양 대사, 종양, 면역 및 노화와 같은 다양한 생리학적 또는 병리학적 상태와 밀접하게 관련된다(17</sup...

무균 동물은 검출 가능한 살아있는 미생물과 기생충이 없는 동물이다1. 무균 배아는 무균 상태에서 모체를 해부하여 얻을 수 있으며, 이후 장벽 시스템에서 키울 수 있다2. 이러한 동물은 장내 미생물군, 면역체계 및 신진대사와 같은 동물에 대한 미생물의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있다1. 특정 기술적 수단을 사용하면 많은 곤충과 심지어 포유류까지도 불임이 될 수 있습니다 3,4. 무균 동물은 독특한 역할을 하며 미생물학 연구의 다양한 측면에서 널리 사용되어 왔다5. 예를 들어, 무균 나소니아 말벌을 사용하면 미생물이 숙주가 장기간의 외인성 환경 스트레스 하에서 새로운 환경에 적응하는 데 도움이 될 수 있음이 밝혀졌습니다 6,7.
나소니아 기생충은 파리의 번데기에 알을 주입하는 작은 기생 말벌입니다4. 나소니아에는 나소니아 비트리페니스(Nasonia vitripennis), 나소니아 롱기코르니스(Nasonia longicornis), 나소니아 기라울티(Nasonia giraulti), 나소니아 오네이다 8(Nasonia oneida8) 등 4종이 알려져 있다. N. vitripennis는 전 세계적으로 볼 수 있지만 다른 세 종은 북미에서 제한된 범위를 가지고 있습니다4. 나소니아 기생 말벌은 쉬운 재배, 짧은 번식 주기, 서열 게놈 및 장기 휴면 8,9와 같은 특성 때문에 이상적인 모델 곤충으로 간주됩니다. 곤충의 진화, 유전학, 발달, 행동, 공생의 다양한 측면을 연구하는 데 사용할 수 있다10. 또한, 나소니아 기생 말벌은 농업과 질병에서 해로운 파리를 방제하는 데 도움이 될 수 있다11. 무균 곤충 시스템의 성공적인 확립에는 (1) 배아의 살균과 (2) 시험관 내에서 유충에게 무균 식품을 제공하는 두 가지 주요 단계가 포함됩니다. 멸균 식품을 얻기 위해 Brucker와 Bordenstein 12는 2012년에 항생제, 표백제, 소 태아 혈청과 같은 화학 물질을 사용하여 박테리아12를 죽임으로써 Nasonia 사육 배지(NRMv12)를 개발했습니다. 그러나 화학적 멸균 방법은 N. vitripennis13의 낮은 생존율과 퇴실률을 초래했다. 그 후 2016년 Shropshire et al. 항생제 및 기타 물질의 유해성을 제거하기 위해 화학적 살균법 대신 필터 살균법을 사용하여 NRMv2를 개발하고 육종 과정을 최적화했다13. 불행하게도, 이 방법은 여전히 몇 가지 단점을 가지고 있는데, 예를 들어 배지 준비 및 사용과 관련된 어려움, 배아, 유충 및 폐쇄 번데기에 대한 익사, 영양 부족 또는 탈수의 위험도 있다14. Wang과 Brucker14는 최근 Nasonia 양육 미디어 버전 3 (NRMv3)과 무균 사육 버전 2 (GFRv2) 프로토콜을 개선했습니다. 이러한 개선으로 비용과 미디어 소비가 감소했습니다. 그러나 NRMv3는 보관 시간이 매우 짧고 오염에 매우 취약합니다.
NRMv3를 기반으로 NRM 준비 도구 보관 방법과 영양소 비율이 이 연구에서 최적화되었습니다. 이러한 방법론적 개선은 N. vitripennis를 마이크로바이옴 연구의 모델로 사용하는 것을 용이하게 합니다. Wang et al.14에 의해 개발된 NRMv3와 비교하여 NRM 원료 중 하나인 Sarcophaga bullata pupa를 압착하기 위한 개선된 도구는 Wang et al.14에서 사용한 바닥 구멍이 있는 60mL 주사기에 비해 S. bullata 번데기 조직액의 생산 효율을 크게 향상시킵니다. NRM의 영양소 비율을 조정하여 발달 시간에 영향을 미치지 않으면서 무균 나소니아 말벌의 생존율을 어느 정도 증가시켰습니다. 또한, NRM을 소용량 원심분리관(1.5 mL)에 포장하고 -20°C 냉장고에서 냉동시켜 보관 시간을 연장하였다. NRM 준비를 위한 숙주 및 소스로 집파리 Lucilia sericata를 사용했지만 이 프로토콜은 실험실에서 사용할 수 있는 다른 Nasonia 숙주에 적용될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 Sterile vacuum filter</td>
			<td>NEST</td>
			<td>331011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SodiumHypochlorite</td>
			<td>LIRCON</td>
			<td>XB-84BS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mesh nylon net</td>
			<td>BIOBYING</td>
			<td>BY-378Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24&#160;well-plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>702001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8, 1.2, 0.8, and 0.45 &#181;m filters</td>
			<td>Shanghai Xingya Purification Material Factory</td>
			<td>HN-AA-JT-10079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethyl alcohol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>E809057-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>BIOLOGIX</td>
			<td>15-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Drosophila Medium</td>
			<td>Boer</td>
			<td>B645446-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Bioroyee</td>
			<td>17-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garlic press</td>
			<td>Taobao</td>
			<td>No Catalog numbers</td>
			<td>Purchase on Taobao</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucillia sericata pupae</td>
			<td>Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>No Catalog numbers</td>
			<td>Purchase on Taobao</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small writing brush</td>
			<td>Cestidur</td>
			<td>BL0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>SOPTOP</td>
			<td>RX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>SALMART</td>
			<td>A109001-56</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the rearing procedure of germ-free wasps

무균 사육 기술은 무균 또는 거의 무균 상태에서 곤충을 배양하는 방법으로 곤충 미생물군에 대한 외부 미생물의 영향을 효과적으로 제거하여 곤충 미생물군 연구의 급속한 발전을 촉진할 수 있습니다. 나소니아(말벌속)는 기생 말벌 곤충으로 수명이 짧고 유전적 변이가 높으며 조작이 용이한 등 많은 장점을 가지고 있으며 곤충 모델 시스템으로 널리 사용됩니다. 동물의 미생물 수만 줄일 수 있는 항생제 처리와 달리 무균 사육 기술은 동물의 미생물 구성과 양을 모두 제어할 수 있어 숙주-미생물 상호 작용 연구를 더욱 용이하게 합니다. 그러나 이전 버전의 나소니아 사육 배지(NRM)는 복잡하고 시간이 많이 소요되는 준비 과정, 박테리아 또는 곰팡이에 의한 쉬운 오염, 짧은 보관 시간 등 몇 가지 결함과 문제가 있습니다. 따라서 본 연구에서는 NRM 준비 과정에서 사용되는 도구, 보관 조건 및 구성 요소 비율을 최적화하여 이러한 문제를 해결합니다. 최적화된 배지는 -20°C에서 최소 3개월 동안 보관할 수 있으며 무균 말벌에게 먹이를 주는 동안 NRM 오염 가능성을 제거할 수 있습니다. 이것은 Nasonia를 미생물 연구의 모델로 사용하는 데 중요한 무균 Nasonia의 생존율과 건강 수준을 더욱 향상시킵니다.

Germ-free animals are animals that have no detectable living microorganisms and parasites1. Germ-free embryos can be obtained by dissecting the mother under aseptic conditions and subsequently raised in barrier systems2. Such animals can be used to study the effects of microorganisms on animals, such as on the intestinal microbiota, immune system, and metabolism1. With certain technical means, many insects and even mammals can be rendered sterile3,4. Germ-free animals have a unique role and have been widely used in various aspects of microbiology research5. For example, the use of germ-free Nasonia wasps has revealed that microorganisms can help hosts adapt to new environments under long-term exogenous environmental stress6,7.
Nasonia parasitoids are small parasitic wasps that inject their eggs into the pupae of flies4. There are four known species of Nasonia, including Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti, and Nasonia oneida8. N. vitripennis can be found worldwide, while the other three species have limited ranges in North America4. Nasonia parasitoid wasps are regarded as ideal model insects because of their characteristics, such as easy cultivation, short reproduction cycle, sequenced genome, and long term diapause8,9. They can be used to study various aspects of insect evolution, genetics, development, behavior, and symbiosis10. Moreover, Nasonia parasitoid wasps can also help control harmful flies in agriculture and disease11. The successful establishment of a sterile insect system involves two major steps: (1) sterilization of the embryos and (2) provision of sterile food to the larvae in vitro. In order to obtain sterile food, Brucker and Bordenstein12 developed Nasonia rearing medium (NRMv1) in 2012 by using chemicals such as antibiotics, bleach, and fetal bovine serum to kill bacteria12. However, the chemical sterilization method resulted in low survival and eclosion rates of N. vitripennis13. Then, in 2016, Shropshire et al. developed NRMv2 by using a filter sterilization method instead of a chemical sterilization method to eliminate the hazards of antibiotics and other substances, and optimized the breeding process13. Unfortunately, this method still has some disadvantages, such as the challenges associated with preparing and using the medium, as well as the risks of drowning, underfeeding, or dehydration for the embryos, larvae, and closed pupae14. Wang and Brucker14 recently improved the Nasonia rearing media version 3 (NRMv3) and the germ-free rearing version 2 (GFRv2) protocols. These improvements reduced the cost and media consumption. However, the NRMv3 has a very short storage time and is highly susceptible to contamination.
Building on NRMv3, the NRM preparation tool storage method and nutrient ratio were optimized in this study. This methodological refinement facilitates using N. vitripennis as a model for microbiome studies. Compared with the NRMv3 developed by Wang et al.14, the improved tool for squeezing Sarcophaga bullata pupa, one of the NRM raw materials, greatly enhances the production efficiency of S. bullata pupa tissue fluid compared with the 60 mL syringe with a bottom hole used by Wang et al.14. We adjusted the nutrient ratio of NRM, which led to a certain increase in the survival rate of germ-free Nasonia wasps without affecting their development time. In addition, the NRM was packed into small-capacity centrifuge tubes (1.5 mL) and frozen in a -20 &#176;C refrigerator to extend the storage time. It is worth noting that while we used the housefly Lucilia sericata as the host and source for NRM preparation, this protocol can likely be adapted for other Nasonia hosts that are available in the laboratory.

저자 스포트라이트: 무균 말벌의 사육 절차 최적화  

무균 말벌의 사육 절차 최적화

Our research focuses on the study of insect-microbiota interactions, specifically investigating the impact of in those symbiotic bacteria and exploring the dynamics of host-microbe relationships. Germ-free Nasonia is an essential tool for conducting this research. Current research utilize technologies such as high-throughput sequencing, germ-free insect rearing, transcriptoptomics, proteomics, and advanced microscope.This tool enable comprehensive analysis and virtualization of insect-microbe host interaction for advancing our understanding of this field. The optimized the procedure for preparing the Nasonia Rearing Medium provides economic advantages and saves time and effort. Additionally, it effectively reduces the risk of NRM contamination during the feeding process, greatly improving the efficiency of producing aseptic Nasonia

NRM의 준비 효율성은 준비 도구를 개선하여 크게 향상되었습니다. 또한 사료 공급 과정에서 NRM 오염 문제는 전략 및 보존 방법을 최적화하여 제거되었습니다. 동시에, 조정된 NRM은 L. sericata 를 숙주로 하는 무균 말벌의 성장과 발달에 더 적합한 영양 비율을 가졌습니다. 유충에서 번데기까지 무균 말벌의 생존율은 GFRv2를 사용하여 NRMv3로 사육한 무균 말벌에 비해 크게 향상되었습니다(<strong c...

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나소니아 말벌 배아를 12-24시간 동안 기생시킨 후 Lucillia sericata 번데기에서 해부하고 알코올과 10% 차아염소산나트륨 용액으로 세척하여 무균 배아를 얻었습니다. 무균 배아를 사육하고 시험관 내에서 성장 및 발달할 수 있도록 Nasonia 사육 배지를 공급한 후 무균 Nasonia 성인을 얻었습니다.

Aseptic rearing technology is a method of culturing insects under sterile or almost sterile conditions, which can effectively eliminate the influence of ...

우리의 연구는 곤충-미생물 상호 작용 연구에 중점을 두고 있으며, 특히 이러한 공생 박테리아의 영향을 조사하고 숙주-미생물 관계의 역학을 탐구합니다. 무균 Nasonia는 이 연구를 수행하는 데 필수적인 도구입니다. 현재 연구는 고처리량 시퀀싱, 무균 곤충 사육, 전사광학체학, 단백질체학 및 고급 현미경과 같은 기술을 활용합니다.이 도구는 이 분야에 대한 이해를 높이기 위해 곤충-미생물 숙주 상호 작용의 포괄적인 분석 및 가상화를 가능하게 합니다. Nasonia Rearing Medium을 준비하기 위한 최적화된 절차는 경제적 이점을 제공하고 시간과 노력을 절약합니다. 또한 공급 과정에서 NRM 오염 위험을 효과적으로 줄여 무균 Nasonia를 생산하는 효율성을 크게 향상시킵니다

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Optimizing the Rearing Procedure of Germ-Free Wasps

1.3K 조회수.  Chinese Academy of Sciences. 우리의 연구는 곤충-미생물 상호 작용 연구에 중점을 두고 있으며, 특히 이러한 공생 박테리아의 영향을 조사하고 숙주-미생물 관계의 역학을 탐구합니다. 무균 Nasonia는 이 연구를 수행하는 데 필수적인 도구입니다. 현재 연구는 고처리량 시퀀싱, 무균 곤충 사육, 전사광학체학, 단백질체학 및 고급 현미경과 같은 기술을 활용합니다.이 도구는 이 분야에 대한 이해를 높?...