نحن نعترف التمويل من البرنامج الكيميائية والبيولوجية المقاييس من مكتب الوطني للقياس في المملكة المتحدة. نشكر سيباستيان فان دي ليندي، ميكلوس Erdelyi واريك ريس للحصول على المشورة والاقتراحات الفنية. نشكر ميكلوس Erdelyi، اريك ريس وماكس Ryadnov للتعليقات مفيدة والمناقشات حول هذا المخطوط.

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

وتبين لنا مع بعض عينات اختبار بسيط وبحرية المتاحة تجهيز عاصفة مطيرة البرمجيات فمن الممكن لتحسين STORM فائقة التصوير القرار. وهذه الأدوات والأساليب توفير نقطة انطلاق مفيدة للمستخدمين الجدد وطرق للمستخدمين ذوي الخبرة لزيادة الثقة في المجاهر واستخدامها منهم لدراسة البنيات البيولوجية والخلوية مع التفاصيل لم يسبق لها مثيل. باستخدام مزيج من عينات مع هياكل معروفة أو مفهومة جيدا وخوارزمية التي يمكن أن تنتج عددا من المفيد مقاييس جودة الصورة، مثل تقديرات الدقة متوسط، عدد التعريب ورسوم بيانية تظهر أنه من الممكن لتحسين جودة الصورة والحصول على قدر أكبر من الثقة في عملية التصوير STORM. ليس هناك مقاس واحد يناسب الجميع النهج إلى الحصول على البيانات كما أن هناك عددا من تكوينات مختلفة المجهر التجاري والذي يتم بناؤه ذاتيا التي يمكن استخدامها. وعلاوة على ذلك، هناك العديد من إعداد العينات وصورة الخطوات التي يمكن الاستحواذ influجربت بالتالي فإن الصورة النهائية لها أدوات البرمجيات واختبار عينات أمر بالغ الأهمية لفهم وتحسين جودة الصورة STORM. بالإضافة هذه البروتوكولات يمكن أن توفر وسائل مفيدة وأقل غموضا من أي استكشاف المشكلات التي قد تنشأ. على سبيل المثال العينة ديكستران هو وسيلة مفيدة جدا لتحديد إذا كان هناك أي اختلال شعاع الليزر أو الإضاءة غير المتكافئ للالعينة. إذا كانت هناك مخاوف من أن المخزن المؤقت التحول قد لا تعمل اختبار بصرية بسيطة جدا لمعرفة ما إذا كان هناك أي و&#39;امض&#39; مساعدة. خيوط الأكتين هي طريقة مفيدة لقياس القرار باستخدام مقارنات FWHM فضلا عن تسليط الضوء على الانجراف وmislocalization التحف. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن وسائل فائقة الدقة على أساس التوطين يمكن أن يكون كثافة fluorophore الحساسة، وبغض النظر عن العوامل المساهمة الأخرى، مثل التعرض مرات، ومعدلات الإطار، القوى الليزر والطريقة تتم معالجة الصورة، فمن المستحيل لتعيين قرار لالمجهر معين ونفترض أن جميع الصور سوف يكون هذا القرار. ما هو ممكن، ولكن هو لقياس الجوانب المختلفة للقرار مثل توضيحات يعني التوطين، توطين عدد 27 والانجراف. حتى لو لم يمكن إدراج علامات إيمانية في كل تجربة ما في وسعهم، على الأقل، يمكن استخدامها لوصف نظام المجهر، والبيئة، وفهم أفضل الاعتبارات التشغيلية مثل كيفية مطلوب الكثير من الوقت للوصول إلى التوازن الحراري بعد بدء التشغيل. وكذلك تصحيح الانحراف الجانبي لل، علامات إيمانية يمكن استخدامها لتوصيف والصحيح لالانجراف المحوري، رغم أن هذا يتطلب استخدام عدسة اللابؤرية وآلية التقييم لتصحيح موقف العينة في حين أن الصور يتم الحصول عليها 43. وسوف تشمل أنظمة فائقة الدقة التجارية عادة نوعا من السيطرة على الاستقرار أو التركيز قفل آلية، والتي قد يكون حلا أكثر عملية لتصحيح الانحراف التركيز. هناكإعادة بدائل لطلاء وجه التحديد غير الزجاج مع ديكستران، مثل استخدام الأصباغ مباشرة أو الجزيئات المكورات أخرى، مثل الأجسام المضادة الثانوية. وجود قيود على هذه النهج هو أن عدد الجزيئات بد أن الزجاج غير معروف. هياكل الخيطية البديلة التي استخدمت تشمل الأنابيب الدقيقة 28 والحمض النووي 21. ومع ذلك، فإن الجمع بين حجم صغير جدا ومريحة الكواشف المتاحة تجاريا جعل الأكتين بديلا جذابا، خاصة أن مسافة الفصل بين شعيرات المتباينة أو متفرعة يمكن أن يكون أيضا من المفيد قياس أداء النظام 27. هناك مجالا لمزيد من عينات الاختبار التنمية، على الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا في هذا المجال 28،29،46،47. على وجه الخصوص، يقدم التصوير متعدد الألوان عددا من التحديات في جميع الجوانب الرئيسية 3 من التصوير، ووضع العلامات العينة، الحصول على الصور (الأجهزة)، وبرنامج (معالجة الصور والمحاذاة). لقد كان هناك لعدد من المنشورات معالجة هذه الجوانب 4-6 وبالتالي فمن الواضح أن العينات واختبار المنهجيات المناسبة حاسمة لتوليد وتفسير موثوق هذه الأنواع من الصور. في الواقع، في الآونة الأخيرة تبين أن dSTORM يمكن استخدامها لاتخاذ صورتين لون، ولحل، وطبيعة متناظرة للغاية من مجمع المسام النووية واقترح المؤلفان أن هذا من شأنه أن يكون وسيلة مثالية لتقييم أداء تصويبات انحراف لوني 45. نهج آخر للاهتمام هو استخدام اوريغامي الحمض النووي لإنشاء nanoruler، مما يخلق إمكانية fluorophores المواقع على مسافات حيود فرعية محددة بصرف النظر 46. وهذا يوفر وسيلة لتقييم القرار وصنع قياسات المسافة. ومع ذلك، فإن الهدف النهائي هو تطبيق هذه التقنيات فائقة الدقة لعينات غير مثالية، مثل الخلايا، والتي هي معقدة هياكل ثلاثية الأبعاد. في هذه الحالة، وهو مزيج من أكثر فهم دقيق لرانه أسلوب جنبا إلى جنب مع أدوات البرمجيات التي تساعد المستخدم في الحصول على البيانات ومعالجتها بالطرق المناسبة، وتوفير مقاييس الصورة من المرجح أن يكون الجواب النهائي. 28،29،47،48

مؤخرا مجموعة من تقنيات المجهر الضوئي تم تطويرها، عادة ما يشار إليها باسم فائقة القرار المجهري أو nanoscopy، والتي يمكن تجاوز الحد الحيود وتوليد الصور مع قرارات 100 نانومتر أو أفضل 1،2. منذ إعلان فائقة الدقة المجهر بأنها طريقة طرق الطبيعة من السنة في عام 2008، كان هناك قدر كبير من تطوير المجاهر القائم على الترجمة. على سبيل المثال، هناك تطبيقات متعددة الألوان 3-6، 3D تطبيقات 7-12، وتطبيقات الخلايا الحية حتى 5،13-17. علاوة على ذلك، كما يتم تسويقها هذه الأنظمة ويتم الآن يشقون طريقهم للخروج من المختبرات والبصريات في أيدي علماء الأحياء الخلايا ومن المرجح أن تكون زيادة أخرى في استخدامها وتطبيقها على الأسئلة الطبية الحيوية هناك. فرع واحد من هذه العائلة هو القائم على أساليب الترجمة التي تعمل عن طريق بناء صورة جزيء على حدة جزيء. أنان أجل القيام بذلك، يجب أن تنتقل غالبية الجزيئات الفلورسنت داخل العينة من ذلك أنه ليس هناك سوى عدد قليل من جزيئات تفصل مكانيا تنشط في أي وقت واحد. ثم يتم تبديل هذه الجزيئات بسرعة وخارجها، ويتم أخذ العديد من الصور بحيث يتم تصوير جزء كبير من السكان لتعكس البنية الأساسية بدقة الحيود الفرعية. تم نشر عدد من النهج بما في ذلك GSDIM 18، PALM 19، fPALM 20، 21 STORM وRESOLFT 22. ويمكن بعد ذلك الخوارزميات التي تقيس الموقف من الكشف عن جزيء واحد يمكن استخدامها لتحديد الموقف الفعلي للجزيء مع توضيحات أفضل من 20 نانومتر باستخدام المناسب جاوس 23، على سبيل المثال rapidSTORM 24،25 QuickPALM 26، palm3d 12 و 27 عاصفة مطيرة. عندما التصوير الخلايا أو العينات البيولوجية الأخرى، التي لديها كثافة جزيء عالية، وبالتالي من الضروري اتخاذ عدة آلاف من الأطرهذا وامض، مفصولة مكانيا، إشارة من أجل صورة نسبة كبيرة من الجزيئات المسمى. مؤشر ستوكاستيك المجهر إعادة الإعمار البصرية (STORM) وdSTORM ارتباطا وثيقا وطرق GSDIM وسائل فائقة الدقة على أساس التوطين، والتي ثبت للعمل مع الأصباغ العضوية متاحة تجاريا 21. ومنذ ذلك الحين أظهرت أنها قابلة للتطبيق على عدد من الأصباغ المختلفة 28-30، الأمر الذي يجعل من منهجية جاذبية خاصة نظرا لخصوصية والراحة النسبية لنهج immunolabeling راسخة لأداء مضان المجهري. وبالتالي، هناك سهولة الوصول إلى مجموعة واسعة من تقارن صبغ الأجسام المضادة وصبغ جزيء حيوي، والتي لديها القدرة على أن تستخدم في القائم على التعريب فائقة التصوير القرار. في حين أن المبادئ العامة للSTORM ونهج مماثلة هي بسيطة نسبيا، وأول وهلة الأجهزة وإعداد عينة يبدو سترا نسبياightforward، وهناك عدد من الخطوات في عملية والتي هي حاسمة لتحقيق جودة عالية، وخالية من القطع الأثرية والصور فائقة الدقة. كما هو الحال مع جميع تقنيات الفحص المجهري يمكن اعتبار عملية في 3 خطوات رئيسية: أولا، إعداد العينات، والثانية، الحصول على الصور وثالثا، معالجة الصور و / أو تحليل الصور وتفسيرها. قوة إضافية حل وطريقة لتوليد الصور فائقة الدقة باستخدام النهج القائم على توطين يقدم بعض المشاكل والاعتبارات 31-33 جديدة. بدءا من إعداد العينات، وعند تنفيذ immunolabeling، ولا سيما المناعي غير المباشر حيث يتم استخدام مزيج الأجسام المضادة الأولية والثانوية، وتجدر الإشارة إلى أن صبغة الفلورسنت قد يكون ما يصل إلى 20 نانومتر بعيدا عن جزيء من الفائدة. في حالة الأنابيب الدقيقة، وهذا يؤدي في أقطار من 35-50 نانومتر مقارنة مع قطر أنيبيب المتوقع من 25 نانومتر 28،30. أيضا، يجب أن كثافة وضع العلامات مEET المعايير نيكويست من أجل توليد صورة ذات جودة عالية 14. على سبيل المثال لدقة وضوح الصورة المتوقعة من 20 نانومتر إلى جانب هيكل الخيطية يجب أن يكون هناك جزيء الصبغة على الأقل كل 10 نانومتر 27. في حين تم نشر العديد من الأصباغ للعمل من أجل نهج قائم على توطين الأداء العام للصباغة هي مزيج من لا يقل عن أربعة معايير مهمة وهي الكشف عن الفوتونات في حالة التحول (سطوع كل طرفة - أكثر إشراقا هي أحسن)، والتوازن في خارج دورة العمل (على النقيض من نسبة الأصباغ في خارج مقابل على الدولة - أكثر من هو أفضل بشكل عام)، وجزء البقاء على قيد الحياة (معدل تبيض المنخفضة هي أحسن) وعدد من التحول دورات (عدد يومض في fluorophore - أكثر هو أفضل لارتفاع القرار، وعلى الرغم من أن وميض 1 في fluorophore يمكن أن يكون ميزة لأغراض العد جزيء). وتعقيد الوضع مزيدا من حقيقة أن هذه الخصائص لإعطاء أي صبغة يمكن أن تختلف في ظروف مختلفة عازلة ومع الليزر 28،29 السلطة. بالإضافة إلى ذلك، فضلا عن هذه الاعتبارات STORM فريدة من نوعها، ويمكن تحسين جودة الصورة من خلال تحسين إعداد العينات بنفس الطريقة عن تقنيات مضان المجهري أكثر تقليدية على سبيل المثال عن طريق تقليل تألق ذاتي من خلال تعديل شروط التثبيت واستخدام الكواشف التبريد. أيضا، والتقليل من fluorophores غير ملزمة على وجه التحديد هو المهم، الذي يمكن القيام به من خلال تعديل تركيزات التسمية، مرات الحضانة والحجب وغسل الخطوات. الخطوة الثانية من الحصول على الصور أمر بالغ الأهمية أيضا. سوف الإعدادات المثلى على المجهر تعتمد على الصبغة، والظروف العازلة، كثافة وضع العلامات، ونوع العينة، مثل الطبقات الوحيدة على الزجاج، والخلايا أو عينات الأنسجة. الاعتبارات الرئيسية هي الكاميرا وقت التعرض، ورقم الإطار، وزاوية الإضاءة (TIRF، HILO، برنامج التحصين الموسع) وقوة الليزر. الهدف هو جمع أكبر عدد ممكن مشرق يومض فصل مكانيا في أسرع وقت ممكن. إذا ط الخلفيةق عالية جدا أو يومض ليست مشرقة جدا، وبعبارة أخرى نسبة الإشارة إلى الضوضاء والفقراء، فإن خوارزمية إعادة الإعمار لن تكون قادرة على توطين الوظائف بأكبر. فضلا عن تعظيم الدقة التعريب، أي دقة مع كل موقف جزيء يمكن قياسها، جودة الصورة تعتمد أيضا على عدد كبير من تعريب. إذا تم تصويرها وجود العدد الكافي من الجزيئات من الفائدة، إما بسبب ضعف الكفاءة ووضع العلامات، photobleaching من الإفراط أو رقم الإطار غير كافية، ثم فائقة الدقة الصورة الناتجة ستكون منقط ومتقطع كما لن يكون قد تم الوفاء بمعايير نيكويست 14،27 . وأخيرا، فإن الخطوة الثالثة، ومعالجة الصور، أهمية خاصة بالمقارنة مع تقنيات مضان المجهري القياسية. هناك مجموعة من بحرية ومتاحة تجاريا الخوارزميات، والتي هي على حد سواء ميزة، من حيث الاختيار، ووضع غير مؤات، لأنه يمكن أن يكون مربكا لمعرفة ث<html> hich هو الأنسب للاستخدام. على سبيل المثال إذا البيانات الخام ومتباعدة بشكل جيد يومض متميزة مكانيا ثم واحدة جزيء المناسب خوارزمية يمكن أن تكون دقيقة وفعالة للغاية، على سبيل المثال عن طريق خوارزميات المناسب متفرق المتاحة في عاصفة مطيرة 27، 24،25 rapidSTORM، palm3d 12 و 26 QuickPALM البرمجيات . إذا كانت البيانات الخام يحتوي على الكثير من الإشارات المتداخلة ثم الخوارزميات التي قد تكون أكثر ملاءمة وتشمل DAOSTORM 34، 3B 35 و 36 deconSTORM. علاوة على ذلك، هذه الخوارزميات تتضمن عتبات معايير مختلفة مثل التهم إشارة، أو الفوتونات في طرفة، فضلا عن مختلف الخيارات المختلفة عرض الصور مثل تصور مع وظائف جاوس ممهدة أو رسوم بيانية مع شبكات بكسل، حيث حجم بكسل فائقة الدقة يمكن أن يكون المحددة من قبل المستخدم. كل من هذه الخيارات تغيير مظهر الصورة النهائية ويكون لها آثار على تفسير الصور وتحليلها. &gt; ولذلك، فإننا نقدم 3 عينات الاختبار التي سوف توفر للمستخدم جديدة مع نقطة انطلاق لالمستندة إلى توطين التجارب قائم على الأصباغ فائقة القرار، الذي من أجل وضوح سنشير إليها STORM، والمستخدمين ذوي الخبرة الفرصة ل مزيد من تحسين تجاربهم. الأول، فمن الممكن أن معطف سطح الزجاج مع طبقة من الفلورسنت ديكستران صبغ المترافقة. هذا يوفر وسيلة سريعة وبسيطة لإثبات أن المجهر، وصبغ عازلة تعمل على توليد وامض إشارة الفلورسنت. ويمكن بعد ذلك طريقة تمديدها من خلال مقارنة متوسط ​​الدقة توطين وعدد المقاييس التي تم إنشاؤها بواسطة عاصفة مطيرة لتحسين الظروف العازلة، ضبط الحصول على الصور واختبار الأصباغ المختلفة. الثانية، نقدم بروتوكول بسيط لإعداد خيوط الأكتين على الزجاج التي يمكن وصفها بسهولة باستخدام تقارن phalloidin صبغ. توفر هذه الهياكل مثالية لأخذ القياسات من القرار 27 وعادة العرض الكامل نصف كحد أقصى (FWHM)من يعطى خيوط كتقدير التجريبية من القرار 37. تجدر الإشارة إلى أن القرار يختلف بين العينات وبين الصور داخل نفس العينة لأن القرار في القائم على التعريب فائقة القرار المجهري هي وظيفة من سطوع fluorophore، الضوضاء في الخلفية وكثافة توطين 27 وهذه ليست بالضرورة ثابتة طوال العينة. تستخدم خيوط الأكتين لإظهار القطع الأثرية المحتملة مثل mislocalizations والانجراف وكيف يمكن تحديدها مع ميزات البرنامج داخل عاصفة مطيرة. وعلاوة على ذلك، نحن تصف استخدام علامات إيمانية الفلورسنت لكل قياس والانجراف الصحيح. والثالث، يوصف تلطيخ الخلايا مع عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي) تقارن صبغ. يوفر صندوق تعديل العولمة الأوروبي مؤشرا مفيدا لأداء صورة فائقة الدقة، وذلك لأن نسبة من مستقبلات على سطح الخلية يخضع الإلتقام عبر الحويصلات، والتي هي حيود شبه هياكل الحجم من حوالي 50-150 نم في القطر 27،38،39.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labtek Imaging chamberglass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CBR-166-390E</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF Objective Lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon 897</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>640 nm laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>iBEAM-SMART-640-S</td>
			<td>*150 mW - for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>*Acquisition software (controlling hardware)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
			<td>Dell</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Image analysis and processing <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rainSTORM</td>
			<td>Laser Analytics Group (Cambridge) software</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources" target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Running rainSTORM</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/" target="_blank">http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Example of self-built STORM/PALM microscopes</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Also see reference 29 <a href="http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope" target="_blank">http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Materials &amp; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX70013065</td>
			<td>1; 2; 3; 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td>1.1; 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-22914</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General actin buffer</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>BSA01</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preformed-actin filaments</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>AKF99</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phallodin-Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres (0.1 micron)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-7279</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX31966021</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX10500064</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Step</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dishes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>734-0006</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF - Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E35351</td>
			<td>4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>4.3, 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde - 10% solution EM grade</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>04018-1</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C100</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4706</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93352</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7528</td>
			<td>5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6500</td>
			<td>5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2289</td>
			<td>5.1; 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Reagents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

test samples for optimizing storm super-resolution microscopy

STORM هو فائقة الدقة تقنية المجهر وضعت مؤخرا مع ما يصل إلى 10 مرات قرار أفضل من تقنيات مضان المجهري القياسية. لكن، وكما يتم الحصول على الصورة بطريقة مختلفة جدا من المعتاد، من خلال بناء صورة جزيء على حدة جزيء، وهناك بعض تحديات كبيرة للمستخدمين في محاولة لتحسين صورتهم الاستحواذ. من أجل مساعدة هذه العملية وكسب مزيد من التبصر في كيفية عمل STORM نقدم إعداد 3 عينات الاختبار ومنهجية لاكتساب ومعالجة STORM الصور فائقة الدقة مع قرارات نموذجية من بين 30-50 نانومتر. من خلال الجمع بين عينات الاختبار مع استخدام برامج معالجة متاحة بحرية عاصفة مطيرة فمن الممكن الحصول على قدر كبير من المعلومات حول جودة الصورة وحلها. استخدام هذه المقاييس فمن الممكن بعد ذلك لتحسين إجراءات التصوير من البصريات، لأخذ عينات من إعداد واختيار الصبغة، والظروف العازلة، والإعدادات الحصول على الصور. لديناعرض أمثلة ليسوتو لبعض المشاكل الشائعة التي تؤدي إلى سوء جودة الصورة، مثل الانجراف الجانبية، حيث يتحرك عينة خلال الحصول على الصور وكثافة المشاكل الناتجة في &#39;mislocalization &quot;ظاهرة ذات الصلة.

Watch this Scientific Journal Video about Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

وصفنا إعداد ثلاث عينات الاختبار وكيف يمكن استخدامها لتحسين وتقييم أداء المجاهر STORM. باستخدام هذه الأمثلة وتبين لنا كيفية الحصول على البيانات الخام ثم معالجته للحصول على الصور فائقة الدقة في خلايا حوالي 30-50 قرار نانومتر.

عينات الاختبار لتحسين STORM فائقة الدقة المجهر

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

test-samples-for-optimizing-storm-super-resolution-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

31.0K Views.  National Physical Laboratory.  وصفنا إعداد ثلاث عينات الاختبار وكيف يمكن استخدامها لتحسين وتقييم أداء المجاهر STORM. باستخدام هذه الأمثلة وتبين لنا كيفية الحصول على البيانات الخام ثم معالجته للحصول على الصور فائقة الدقة في خلايا حوالي 30-50 قرار نانومتر. 

Video: Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

فائقة التصوير القرار من ماكينات شعبة الجرثومي

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

فائقة الدقة التصوير من Cytokinetic Z الدائري في البكتيريا تعيش طريق سريع منظم 3D الإضاءة المجهري (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

ثلاثي الأبعاد فائقة الدقة المجهر من الشعيرات F-أكتين من التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

مسح بروتوكولات المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لإشكالية النبات، طلائعيات بيضية، وعينات الفطرية

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

الدولة الأرض استنفاد القرار فائقة التصوير في خلايا الثدييات

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

تطبيق القرار فائقة السرعة سرعة الفحص المجهري في هدب الأولية الحية

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to chromatic aberration and the imperfect alignment of cameras, images acquired in each channel may be shifted, and magnified, as well as rotated relative to each other in any of the three dimensions. With the classical calibration method, chromatic shifts are measured by multicolor beads attached to the surface of a coverslip, and a number of software are available to measure the chromatic shifts from such calibration samples. However, chromatic aberration can vary with depth, change with observation conditions and be induced by the biological sample itself, thus hindering determination of the true amount of chromatic shift in the sample of interest and across the volume. Correcting chromatic shifts at higher accuracy is particularly relevant for super-resolution microscopy where only slight chromatic shifts may affect quantitative analyses and alter the interpretation of multicolor images. We have developed an open-source software Chromagnon and accompanying methods to measure and correct 3D chromatic shifts in biological samples. Here we provide a detailed application protocol that includes special requirements for sample preparation, data acquisition, and software processing to measure chromatic shifts in biological samples of interest.

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Correction of chromatic shifts in three-dimensional (3D) multicolor fluorescence microscopy images is crucial for quantitative data analyses. This protocol is developed to measure and correct chromatic shifts in biological samples through acquisition of suitable reference images and processing with the open-source software, Chromagnon.

تصحيح عالي الدقة لتحولات لونية ثلاثية الأبعاد في عصر التصوير البيولوجي فائق الدقة باستخدام Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

فائقة الدقة تصوير الخلايا الحية من الهياكل دون الخلوية

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...