Wir danken dem Histologie-Kern des National Eye Institute (NEI) für den Einsatz des konfokalen Zeiss-Systems. Diese Arbeit wurde aus Mitteln des NEI IRP (Förderkennzeichen ZIA EY000533-04) unterstützt.

Modellierung und Analyse der Netzhautdegeneration

<ol>
	<li>Kanow, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye.">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, e28899 (2017).</li><li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+utilizes+fatty+acids+for+ketogenesis.">The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration:+Biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies.">Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).</li><li>Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+of+low-density+lipoproteins+through+Bruch's+membrane+and+choroid.">Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).</li><li>Curcio, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esterified+and+unesterified+cholesterol+in+drusen+and+basal+deposits+of+eyes+with+age-related+maculopathy.">Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy.</a> Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).</li><li>Miyagishima, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+modulation+ameliorates+dominant+disease+phenotypes+of+CTRP5+variant+in+retinal+degeneration.">AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration.</a> Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).</li><li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+restoring+drugs+suppress+macular+degeneration+phenotypes+in+an+iPSC+model.">Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model.</a> Nature Communications. 12 (1), 7293 (2021).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Hallam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+induced+pluripotent+stem+cell+patient+specific+model+of+complement+factor+H+(Y402H)+polymorphism+displays+characteristic+features+of+age-related+macular+degeneration+and+indicates+a+beneficial+role+for+UV+light+exposure.">An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure.</a> Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).</li><li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101582 (2022).</li><li>Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+the+Stargardt+phenotype+in+Abca4+knockout+mice+through+inhibition+of+vitamin+A+dimerization.">Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).</li><li>GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blindness+and+Vision+Impairment+Collaborators.+Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years,+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020:+the+Right+to+Sight:+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li></ol>

Keine Offenlegungen.

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur effizienten Markierung, Abbildung und Quantifizierung von Lipidablagerungen in monogenen und polygenen In-vitro-Krankheitsmodellen für degenerative Augenerkrankungen. Die KI-basierte Software LipidUNet kann auf drei gängige Lipidmarker, APOE, Nile Red und BODIPY, angewendet werden und bietet eine schnelle, automatische Analysemethode, die eine standardisierte und unvoreingenommene Quantifizierung ermöglicht.
Die Haupteinschränkung von LipidUNet ist die Tatsache, dass der Trainingsdatensatz für die KI auf Bilder mit 40-facher Vergrößerung von Zellen beschränkt war, die in einer 96-Well-Platte kultiviert wurden. Aufgrund des Trainingsbildsatzes ist LipidUNet in seiner jetzigen Form auf die Analyse von Bildern mit 40-facher Vergrößerung beschränkt. Die Software kann verwendet werden, um 40-fache Bilder von Zellen zu analysieren, die auf anderen Kulturoberflächen als einer 96-Well-Platte kultiviert wurden, aber es sollte darauf geachtet werden, die generierten Ausgabemasken zu untersuchen, um die genaue Schwellenwertbildung durch die Software zu überprüfen. Es werden mehr Bildsätze (bei unterschiedlichen Vergrößerungen) benötigt, um den Umfang der zu analysierenden Proben/Bilder zu erweitern.
Das Protokoll besteht aus mehreren kritischen Schritten. Im Schritt des Lipidmarkers sollte der Benutzer bestätigen, dass die von ihm gewählte Markierungsverbindung (BODIPY, APOE, Nilrot) seine Probe effektiv markiert hat. Reife RPE-Zellen sind oft stark pigmentiert, was das Fluoreszenzsignal der Antikörper-Immunfärbung beeinträchtigen kann. Wenn das Fluoreszenzsignal schwach ist oder wenn die Hintergrundfärbung zu stark ist, kann LipidUNet Lipidtröpfchen nicht genau erkennen. Aus einem ähnlichen Grund müssen ordnungsgemäß ausgewählte Erfassungseinstellungen für den automatischen Bildgebungsschritt des Protokolls verwendet werden. Wenn die aufgenommenen Bilder von schlechter Qualität sind, hat LipidUNet Schwierigkeiten, die Bilder richtig zu maskieren, und daher ist die Quantifizierung ungenau (Abbildung 6A-L). Schließlich ist die Nachbearbeitung der Bilder ein wichtiger Schritt, da LipidUNet spezifische Anforderungen an die Software stellt, um zu funktionieren.
Im Vergleich zu Workflows für die Lipidanalyse, die manuelle Schwellenwerte verwenden, oder Techniken, die eine automatische Schwellenwertbildung in Software wie Fiji beinhalten, bietet LipidUNet eine unverzerrte und zuverlässige Segmentierung über Bilder mit variabler Lipidablagerung, was sich in einer geringen Fehlerrate bei der Identifizierung von Lipidpartikeln widerspiegelt (Abbildung 7). Die Software ermöglicht dem Benutzer die Eingabe zusätzlicher Trainingsbilder, was die Analyse von Bildsätzen ermöglicht, die über diejenigen hinausgehen, die ein 40-faches Vergrößerungsobjektiv verwenden, oder sogar solche, die einen anderen Lipidmarker verwenden, wie im Protokoll beschrieben. In Zukunft soll die Software darauf trainiert werden, 3D-Bilder zu analysieren, so dass die Quantifizierung des Lipidablagerungsvolumens möglich ist. Degenerative Augenerkrankungen, die die Ablagerung von Lipiden als Hauptursache für die Pathologie implizieren, sind weit verbreitet, und es wird prognostiziert, dass die Fälle mit zunehmender älterer Bevölkerung zunehmenwerden 13. Genaue Krankheitsmodelle und effiziente Analyseinstrumente, wie wir sie in diesem Protokoll skizziert haben, werden die Entwicklung neuartiger therapeutischer Interventionen ermöglichen.

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht von Zellen, die sich im hinteren Teil des Auges neben retinalen Photorezeptoren befindet. RPE spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des richtigen Sehvermögens, indem es die Photorezeptoren metabolisch und strukturell unterstützt. Gesunde RPE-Zellen zeichnen sich durch eine ausgeprägte hexagonale Morphologie aus. Sie sind durch Tight Junctions verbunden, die es dem RPE ermöglichen, als Barriere zwischen der auf der Basalseite befindlichen Choriokapillaris und den apikal gelegenen Photorezeptoren zu fungieren. Um das Ökosystem der Netzhaut zu erhalten, transportiert RPE wichtige Metaboliten, z. B. Glukose, so zu den Photorezeptoren, dass der Glukoseverbrauch im RPEminimiert wird 1. Aufgrund dieser Einschränkung ist RPE auf andere Metaboliten angewiesen, um seinen Stoffwechselbedarf aufrechtzuerhalten, einschließlich Fettsäuren, die RPE durch β-Oxidation in Ketone umwandelt2. Angesichts der Neigung von RPE, Fettsäuren, die wahrscheinlich aus der Verdauung des äußeren Photorezeptorsegments (POS) recycelt werden, als Energiequelle zu nutzen, führen nachteilige Veränderungen der Lipidverarbeitungswege bei RPE häufig zu monogenen und polygenen degenerativen Netzhauterkrankungen oder sind daran beteiligt3.
Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD), eine polygene degenerative Augenerkrankung, die eine RPE-Degeneration verursacht, wurde ebenfalls mit einer fehlerhaften Autophagie und einem abweichenden Fettstoffwechsel in der RPE-Monoschicht in Verbindung gebracht. Das Versagen einer dysfunktionalen RPE-Monoschicht, POS zu verarbeiten und andere kritische Funktionen auszuführen, führt zu extrazellulären (sub-RPE) Ablagerungen, die als basale lineare Ablagerungen (BLinD) bezeichnet werden und sich zwischen dem RPE und der Bruchschen Membran befinden - ein Kennzeichen von AMD-Pathologien. Zu den Hauptbestandteilen von BLinD gehören Lipoproteine, von denen das Apolipoprotein E (APOE)4 am häufigsten vorkommt. Die Anhäufung dünner BLinD-Schichten kann zu weichen Drusen führen, die als klinisches Symptom der AMD 5,6 anerkannt sind.
Mehrere Gruppen haben gezeigt, dass aus Stammzellen gewonnene In-vitro-Krankheitsmodelle, die eine RPE-Dysfunktion verursachen, eine Sub-RPE-Lipidakkumulation aufweisen 7,8,9. Hallam et al. (2017) generierten induziertes pluripotentes Stammzell-abgeleitetes RPE (iRPE) von Patienten mit einem hohen Risiko für AMD aufgrund eines Polymorphismus des CFH-Gens. Das iRPE zeigte eine Drusenakkumulation, wie sie durch APOE gekennzeichnet war, und das Hochrisiko-RPE akkumulierte größere Ablagerungen als das iRPE, das von Patienten mit niedrigem Risiko generiert wurde10.
Um ein In-vitro-Modell zu erstellen, das zelluläre Merkmale der AMD, wie z. B. Lipidtröpfchen und Drusenablagerungen, rekapituliert, wurden iRPE-Linien, die aus Blutproben von Patienten generiert wurden, unter Verwendung eines zuvor veröffentlichten entwicklungsgesteuerten Protokolls etabliert11. Die iRPE wurden komplementkompetentem humanem Serum (CC-HS) unterzogen, einer Lösung, die Anaphylatoxine enthält, die eine mögliche Ursache der AMD nachahmen: eine erhöhte Signalübertragung durch alternative Komplemente8. Die daraus resultierende zelluläre und subzelluläre Ablagerung von Lipidablagerungen wurde mit den gängigen Lipid- und Lipoproteinmarkern APOE, Nile Red und BODIPY gemessen. Anhand dieser Marker konnte gezeigt werden, dass die aktivierte Komplement-Signaltransduktion über CC-HS die Lipidakkumulation in iRPE-Zellen verstärkte8.
Um ein Krankheitsmodell für eine monogene degenerative Erkrankung der Netzhaut zu entwickeln, wurden iRPE-Linien von Patienten mit Morbus Stargardt entwickelt, einer Erkrankung, die durch Mutationen des ABCA4-Gens in RPE verursacht wird. Es wurde bereits gezeigt, dass sich A2E-Lipofuscin, eine intrazelluläre Ablagerung, von der bekannt ist, dass sie hohe Mengen an Phospholipiden und lichtabhängigen Lipidperoxidationsprodukten enthält, im RPE12 ansammelt, wenn ABCA4 ausgeschaltet wird. ABCA4-Knockout-Linien wurden parallel zu den Patientenlinien entwickelt, und beide wurden einer POS-Fütterung unterzogen. Das Stargardt iRPE zeigte eine POS-Phagozytose-induzierte Pathologie mit erhöhter Lipidakkumulation, die durch BODIPY-Färbung quantifiziert wurde. RPE, die aus ABCA4 KO iPSCs gewonnen wurden, wurden einer CC-HS-Behandlung unterzogen; Die Quantifizierung des BODIPY-Signals zeigte auch im Stargardt-Modell einen Defekt im Lipidhandling9.
Angesichts der Prävalenz dieser Krankheiten und des Bedarfs an wirksamen Therapeutika sowie den oben beschriebenen relevanten Krankheitsmodellen besteht die Notwendigkeit, robuste Methoden zur Quantifizierung der Wirksamkeit potenzieller Behandlungen zu etablieren. Um Lipidablagerungen objektiv, automatisiert und standardisiert zu quantifizieren, wurde eine auf maschinellem Lernen basierende Software, LipidUNet, entwickelt, so dass in Kombination mit Maskenanalysewerkzeugen die Lipidablagerung mithilfe der gängigen Marker Nile Red, BODIPY und APOE schnell und effektiv identifiziert werden kann. Die mit dieser Analysepipeline erhaltenen zusammenfassenden Statistiken können dann analysiert und grafisch dargestellt werden, was einen einfachen Vergleich der Behandlungsbedingungen ermöglicht. Der Schaltplan des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls: RPE-Zellen werden auf einer 96-Well-Platte gezüchtet und mit aktivem humanem Serum oder gereinigten Rinderaußensegmenten herausgefordert, um verschiedene Arten von Netzhautdegenerationen in vitro zu modellieren. RPE-Zellen werden fixiert und für Lipoproteinablagerungen mit Nilrot, BODIPY und APOE gefärbt. Ein konfokales Mikroskop wird verwendet, um Z-Stapel von fluoreszenzmarkierten Lipidpartikeln zu erfassen, die anschließend zu 2D-Projektionen mit maximaler Intensität verarbeitet werden. Ein Machine-Learning-Algorithmus wurde darauf trainiert, Lipoproteinpartikel zu erkennen und korrekt zu segmentieren. Zusammenfassende Tabellen mit Partikelanzahl und verschiedenen Formmetriken werden generiert und können für nachfolgende Diagramme und statistische Analysen verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Steriflip filter system</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine, Fraction V</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>160069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21431</td>
			<td>APOE secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOE primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complement competent human serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1-LITER</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A13707-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Slide mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71870-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Alpha</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72485-100MG</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rod Outer Segments (OS)</td>
			<td>InVision Bioresources</td>
			<td>98740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Ultrapure</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14701SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidunet-machine learning-based method of characterization and quantification of lipid deposits using ipsc-derived retinal pigment epithelium

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht aus hexagonalen Zellen, die sich im hinteren Teil des Auges befindet. Es nährt und unterstützt Photorezeptoren und Aderhautkapillaren, führt eine Phagozytose der äußeren Photorezeptorsegmente (POS) durch und sezerniert Zytokine auf polarisierte Weise, um die Homöostase der äußeren Netzhaut aufrechtzuerhalten. Dysfunktionales RPE, das durch Mutationen, Alterung und Umweltfaktoren verursacht wird, führt zur Degeneration anderer Netzhautschichten und zum Verlust des Sehvermögens. Ein charakteristisches phänotypisches Merkmal degenerierender RPE sind intra- und subzelluläre lipidreiche Ablagerungen. Diese Ablagerungen sind ein häufiger Phänotyp bei verschiedenen degenerativen Erkrankungen der Netzhaut. Um den Lipiddepot-Phänotyp monogener Netzhautdegenerationen in vitro zu reproduzieren, wurde induziertes pluripotentes Stammzell-abgeleitetes RPE (iRPE) aus den Fibroblasten der Patienten erzeugt. Zelllinien, die von Patienten mit Stargardt und spät einsetzender Netzhautdegeneration (L-ORD) generiert wurden, wurden 7 Tage lang mit POS gefüttert, um die physiologische Funktion von RPE zu replizieren, die bei diesen Erkrankungen eine durch POS-Phagozytose induzierte Pathologie verursachte. Um ein Modell für die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) zu entwickeln, eine polygene Erkrankung, die mit alternativer Komplementaktivierung assoziiert ist, wurde iRPE mit alternativen Komplement-Anaphylatoxinen konfrontiert. Die intra- und subzellulären Lipiddepots wurden mit Nilrot, Bor-Dipyrromethen (BODIPY) und Apolipoprotein E (APOE) charakterisiert. Um die Dichte von Lipidablagerungen zu quantifizieren, wurde eine auf maschinellem Lernen basierende Software, LipidUNet, entwickelt. Die Software wurde mit Projektionsbildern von iRPE auf Kulturoberflächen mit maximaler Intensität trainiert. In Zukunft soll es darauf trainiert werden, dreidimensionale (3D) Bilder zu analysieren und das Volumen von Lipidtröpfchen zu quantifizieren. Die LipidUNet-Software wird eine wertvolle Ressource für die Entdeckung von Medikamenten sein, die die Lipidakkumulation in Krankheitsmodellen verringern.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of cells located in the back of the eye adjacent to retinal photoreceptors. RPE plays a vital role in maintaining proper vision by providing metabolic and structural support to the photoreceptors. Healthy RPE cells are characterized by a distinct hexagonal morphology. They are connected by tight junctions, which allow the RPE to act as a barrier between the choriocapillaris located on its basal side and photoreceptors located apically. To maintain the retinal ecosystem, RPE shuttles key metabolites, e.g., glucose, to photoreceptors in a way that minimizes glucose consumption in the RPE1. Due to this limitation, RPE depends on other metabolites to maintain their metabolic needs, including fatty acids, which RPE converts to ketones through &#946;-oxidation2. Given the propensity of RPE to utilize fatty acids, which are likely recycled from photoreceptor outer segment (POS) digestion, as an energy source, detrimental changes to the lipid processing pathways in RPE often lead to, or are implicated in, both monogenic and polygenic degenerative retinal diseases3.
Age-related macular degeneration (AMD), a polygenic degenerative eye disease that causes RPE degeneration, has also been linked to aberrant autophagy and lipid metabolism in the RPE monolayer. The failure of a dysfunctional RPE monolayer to process POS and perform other critical functions leads to extracellular (sub-RPE) deposits called basal linear deposits (BLinD) located between the RPE and Bruch&#39;s membrane - a hallmark of AMD pathologies. Major components of BLinD include lipoproteins, the most abundant of which is apolipoprotein E (APOE)4. Accumulation of thin layers of BLinD can lead to soft drusen, which is recognized as a clinical symptom of AMD5,6.
Several groups have shown that stem cell-derived in vitro disease models that cause RPE dysfunction feature sub-RPE lipid accumulation7,8,9. Hallam et al. (2017) generated induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) from patients with a high risk for AMD due to a polymorphism of the CFH gene. The iRPE showed drusen accumulation, as marked by APOE, and the high-risk RPE accumulated larger deposits than iRPE generated from low-risk patients10.
To create an in vitro model that recapitulates cellular hallmarks of AMD, such as lipid droplets and drusen deposition, iRPE lines generated from patient blood samples were established using a previously published developmentally guided protocol11. The iRPE were subjected to complement-competent human serum (CC-HS), a solution containing anaphylatoxins that mimic one possible cause of AMD: increased alternate complement signaling8. The resulting cellular and sub-cellular deposition of lipid deposits was measured using commonly used lipid and lipoprotein markers, APOE, Nile Red, and&#160;BODIPY. Through these markers, it was shown that activated complement signaling via CC-HS exacerbated lipid accumulation in iRPE cells8.
To develop a disease model for a monogenic retinal degenerative disease, iRPE lines were developed from patients with Stargardt disease, a disease caused by mutations to the ABCA4 gene in RPE. It has previously been shown that when ABCA4 is knocked out, A2E lipofuscin, an intracellular deposit known to contain high levels of phospholipids and light-dependent lipid peroxidation products, accumulates inside the RPE12. ABCA4 knockout lines were developed alongside the patient lines, and both were subjected to POS feeding. The Stargardt iRPE demonstrated POS phagocytosis-induced pathology, exhibiting increased lipid accumulation quantified by BODIPY staining. RPE derived from ABCA4 KO iPSCs were subjected to CC-HS treatment; quantification of the BODIPY signal showed a defect in lipid handling in the Stargardt disease model as well9.
Given the prevalence of these diseases and the need for effective therapeutics, along with the relevant disease models described above, there is a need to establish robust methods for quantifying the efficacy of potential treatments. To quantify lipid deposits in a way that is objective, automated, and standardized, a machine-learning-based software, LipidUNet, was created so that, when paired with mask analysis tools, lipid deposition can quickly and effectively be identified using the common markers Nile Red, BODIPY, and APOE. The summary statistics obtained using this analysis pipeline can then be analyzed and displayed graphically, allowing for easy comparison of treatment conditions. The schematic of the protocol is shown in Figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic of the protocol: RPE cells are grown on a 96-well plate and challenged with active human serum or purified bovine outer segments to model different types of retinal degenerations in vitro. RPE cells are fixed and stained for lipoprotein deposits with Nile Red, BODIPY, and APOE. A confocal microscope is used to acquire Z-stacks of fluorescently-labeled lipid particles, which are subsequently processed into 2D maximum intensity projections. A machine-learning algorithm was trained to recognize and correctly segment lipoprotein particles. Summary tables containing particle count and various shape metrics are generated and can be used for subsequent plotting and statistical analysis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Pathogenese der altersbedingten Makuladegeneration und Entdeckung potenzieller Therapien 

LipidUNet-Machine-Learning-basierte Methode zur Charakterisierung und Quantifizierung von Lipidablagerungen unter Verwendung von iPSC-abgeleitetem retinalem Pigmentepithel

In this study, we aim to understand the age-related macro degeneration pathogenesis and find the potential treatment for it. This semi-automated pipeline for lipid droplet analysis provides a robust system to study metabolism and aging diseases. Our lab focuses on finding drug targets for the treatment of AMD either using genetic or small molecule screens that aimed at reducing the accumulation of lipid deposits.

Dieses Protokoll bietet einen Arbeitsablauf zur Identifizierung von Lipidablagerungen, die mit Nilrot, BODIPY und APOE gefärbt wurden. Die entwickelte Software kann Lipidablagerungen automatisch identifizieren und quantifizieren und funktioniert am besten, wenn das skizzierte Protokoll optimiert ist. Enthalten sind Beispiele für erfolgreich differenzierte RPE (Abbildung 3A) und schlecht differenzierte RPE (Abbildung 3B), da die Qualität des Zellmodells einen großen Einfluss auf die Qualität der korrekten Bildsegmentierung hat.
Zwei der drei im Protokoll beschriebenen Marker, Nile Red und BODIPY, werden als kleine kreisförmige Punkte identifiziert, die in fluoreszierenden Bildern deutlich hell sind (Abbildung 5 und Abbildung 6). Ein "positives" Bild aus dem Protokoll wäre eine geeignete Identifizierung dieser unterschiedlichen Lagerstätten (Abbildung 5A-D und Abbildung 5E-H). Ein "negatives" Ergebnis würde eine falsche Segmentierung des Bildes zeigen, indem die Hintergrundfluoreszenz als Ablagerung verwechselt wird, entweder aufgrund einer schwachen Färbung (Abbildung 6A-C und Abbildung 6D-F) oder aufgrund einer hohen Hintergrundintensität (Abbildung 6G-I).
APOE-Ablagerungen haben eine Vielzahl von Größen und Formen und erscheinen eher oval oder unregelmäßig als die kreisförmigen Ablagerungen von Nilrot und BODIPY. Diese Ablagerungen sind auch weniger punktförmig, und die Signalintensität kann zwischen den Ablagerungen aufgrund von Schwankungen in der Permeabilisierung der Probe variieren. Eine korrekte Identifizierung identifiziert jede Lagerstätte, einschließlich derjenigen, die weniger gesättigt sind (Abbildung 5I-L), während eine falsche Segmentierung diese Lagerstätten nicht erfasst (Abbildung 6J-L). Daher ist es wichtig, die Färbe- und Bildgebungsmethoden zu optimieren, um drastische Abweichungen zu vermeiden. Eine Möglichkeit, dies zu tun, besteht darin, bei der Immunfärbung sorgfältig auf die Schritte der Probenpermeabilisierung zu achten. Um das Fluoreszenzsignal zu optimieren, können die Zellen vor der Fixierung und Immunfärbung für APOE lysiert werden, was zu einer gleichmäßigen Sättigung und besseren Segmentierung der APOE-Ablagerungen führt.
Bereitgestellt werden auch segmentierte Bilder von Zellen, die auf einer anderen Kulturplattform als einer 96-Well-Platte gereift sind. Die LipidUNet-Software wurde mit Bildern von Zellen ausgeführt, die auf einem Transwell kultiviert wurden, und während die Lipidablagerungen einen Schwellenwert aufweisen, sind dies auch die Poren in der Transwell-Membran (Abbildung 6M-O). Aufgrund der Ähnlichkeit in Form und Größe maskiert die LipidUNet-Software in ihrer jetzigen Form wahllos sowohl die Lipidablagerungen als auch die Transwellporen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig05.jpg"> Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse. (A,E,I) 96-Well-plattierte RPE werden mit Hoechst-Kernfärbung (blau) und entweder Nilrot (Magenta), BODIPY (grün) oder APOE (orange) gefärbt und sind die Projektionen der maximalen Intensität eines Z-Stapels. (B,F,J) Die Graustufen-Eingabebilder für die LipidUNet-Software nach der Bildverarbeitung. (C,G,K) Von LipidUNet generierte Masken, bei denen alle Ablagerungen korrekt identifiziert werden. (D,H,L) Die Umrisse der einzelnen maskierten Partikel sind nummeriert. Diese Beschriftungen ermöglichen es, jedes Partikel im Bild mit einem Eintrag im Spreadheet mit den Rohdaten zu verbinden. (A-D) zeigt eine Nilrot-Färbung, und die Software ist in der Lage, die Ablagerungen vor dem Hintergrund trotz eines schwächeren Signals genau zu erkennen. (E-H) zeigt einen starken Kontrast zwischen dem BODIPY-Signal und dem Hintergrund, was ideal ist. LipidUNet identifiziert jede Ablagerung im Bild korrekt. (I-L) zeigt ein starkes APOE-Signal und repräsentiert die Variabilität der Signalsättigung, die bei dieser Färbung häufig zu beobachten ist. Nichtsdestotrotz ist die Bildsegmentierung in der Lage, die Grenzen jeder APOE-Lagerstätte zu identifizieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig06.jpg"> Abbildung 6: Suboptimale Ergebnisse. (A,D,G,J,M) 96-gut plattierte RPE werden mit Hoechst-Kernfärbung (blau) und entweder Nilrot (Magenta), BODIPY (grün) oder APOE (orange) gefärbt und sind die maximalen Intensitätsprojektionen eines Z-Stapels. (B,E,H,K,N) Die Graustufen-Eingabebilder für die LipidUNet-Software nach der Bildverarbeitung. (C,F,I,L,O) Die falschen Masken, die von LipidUNet generiert wurden. Rote Kreise zeigen an, wo die Software eine Lipidablagerung falsch erkannt hat. (A-C) Die Verarbeitung von Nile Red ist fehlerhaft, da die Software die Hintergrundfärbung als Ablagerung identifiziert hat. Dies kann häufiger passieren, wenn ein hoher Hintergrund, aber nur wenige Lipidablagerungen im Bild vorhanden sind. Es werden zwei Beispiele für BODIPY-Färbung gezeigt: eine schlechte Bildqualität aufgrund einer (D-F) schwachen BODIPY-Färbung und (G - I) ein starkes BODIPY-Signal mit hohem Hintergrund. In beiden Fällen ist die Software nicht in der Lage, kleine, kreisförmige Lipidablagerungen von dem kreisförmigen Ring im Hintergrund zu unterscheiden, der den Zellkern umgibt. Während die Färbung und Bildgebung optimiert werden sollten, um diese Fehler zu vermeiden, ist die neueste Version von LipidUNet für diese Bilder weitgehend verbessert. (J-L) Falsche APOE-Segmentierung. Da die Ablagerungen in Größe und Signalsättigung variabler sind, hat die Software Schwierigkeiten, einige Ablagerungen zu erkennen. (M-O) RPE auf ein Transwell gesät und mit Nilrot gefärbt. Hier ist ein Ausschnitt des Z-Stapels mit Nilrot-Lipidablagerungen und Transwell-Poren dargestellt. Die Software ist nicht in der Lage, zwischen den beiden zu unterscheiden, wie der rote Kreis mit den Transwell-Poren und der grüne Pfeil, der auf die Ablagerungen von Nil Red zeigt, zeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig07.jpg"> Abbildung 7: Vergleich des Maskenwerkzeugs. (A,B,C) 96-Well-plattierte RPE mit unterschiedlichen Mengen an Lipidablagerungen werden mit Nilrot (rot) identifiziert. Die Bilder werden mit drei verschiedenen gängigen Maskierungsmethoden maskiert: Find Maxima, Max Entropy und Renyi Entropy, und mit der von LipidUNet generierten Maske verglichen. Das Originalbild wird von einer manuellen Zählung der Lipidablagerungen begleitet, während die Masken die vorhergesagten Zahlen für jede Segmentierungsmethode anzeigen. Die durchschnittliche Fehlerquote wurde für jede Segmentierungsmethode mit folgender Formel berechnet: Mittelwert[(|Prognostizierte Anzahl - Manuelle Zählung|/Manuelle Zählung) x 100]. Die von LipidUNet generierte Maske identifiziert im Vergleich zu anderen Maskierungsmethoden Lipidablagerungen in Bildern mit variabler Ablagerung genauer (durchschnittliche Fehlerraten: 23 % LipidUnet, 1164 % Find Maxima, 851 % Max Entropy, 203 % Renyi Entropy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bestandteil</td>
			<td>Kat-Nummer</td>
			<td>Aktien-Konz.</td>
			<td>Finale Konz.</td>
			<td>Ml</td>
		</tr><tr><td>MEM alpha</td>
			<td>12571-063</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
			<td>500</td>
		</tr><tr><td>N2-Ergänzung</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>NA</td>
			<td>1%</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes FBS</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>NA</td>
			<td>5%</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>NMEM NEAA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>10mM</td>
			<td>0,01 Mio.</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Natriumpyruvat</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>100mM</td>
			<td>1mM</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000u/ml</td>
			<td>100U/ml</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Taurin</td>
			<td>T4571</td>
			<td>50mg/ml</td>
			<td>250ug/ml</td>
			<td>2.5</td>
		</tr><tr><td>Hydrocortison</td>
			<td>H6909</td>
			<td>18,1 mg/l</td>
			<td>20ug/L</td>
			<td>0.553</td>
		</tr><tr><td>T3</td>
			<td>T5516</td>
			<td>20ug/L</td>
			<td>0,013 ug/L</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Gesamtvolumen, ml</td>
			<td>548.383</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Zusammensetzung der RPE-MM-Reagenzien. Eine Liste der Reagenzien und optimalen Konzentrationen für RPE-MM.

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Degenerative Augenerkrankungen, die die retinale Pigmentepithelschicht des Auges betreffen, sind monogenen und polygenen Ursprungs. Mehrere Krankheitsmodelle und eine Softwareanwendung, LipidUNet, wurden entwickelt, um Krankheitsmechanismen sowie mögliche therapeutische Interventionen zu untersuchen.

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In dieser Studie wollen wir die altersbedingte Pathogenese der Makrodegeneration verstehen und eine mögliche Behandlung dafür finden. Diese halbautomatische Pipeline für die Lipidtröpfchenanalyse bietet ein robustes System zur Untersuchung des Stoffwechsels und von Alterungskrankheiten. Unser Labor konzentriert sich auf die Suche nach Wirkstoffzielen für die Behandlung von AMD, entweder mit Hilfe von genetischen oder niedermolekularen Screenings, die darauf abzielen, die Ansammlung von Lipidablagerungen zu reduzieren.

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Research

JoVE Journal

Biology

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

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