Nous remercions le noyau d’histologie du National Eye Institute (NEI) pour l’utilisation du système confocal Zeiss. Ce travail a été financé par les fonds du PRI NEI (numéro de subvention ZIA EY000533-04).

Modélisation et analyse de la dégénérescence rétinienne

<ol>
	<li>Kanow, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye.">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, e28899 (2017).</li><li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+utilizes+fatty+acids+for+ketogenesis.">The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration:+Biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies.">Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).</li><li>Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+of+low-density+lipoproteins+through+Bruch's+membrane+and+choroid.">Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).</li><li>Curcio, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esterified+and+unesterified+cholesterol+in+drusen+and+basal+deposits+of+eyes+with+age-related+maculopathy.">Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy.</a> Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).</li><li>Miyagishima, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+modulation+ameliorates+dominant+disease+phenotypes+of+CTRP5+variant+in+retinal+degeneration.">AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration.</a> Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).</li><li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+restoring+drugs+suppress+macular+degeneration+phenotypes+in+an+iPSC+model.">Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model.</a> Nature Communications. 12 (1), 7293 (2021).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Hallam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+induced+pluripotent+stem+cell+patient+specific+model+of+complement+factor+H+(Y402H)+polymorphism+displays+characteristic+features+of+age-related+macular+degeneration+and+indicates+a+beneficial+role+for+UV+light+exposure.">An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure.</a> Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).</li><li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101582 (2022).</li><li>Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+the+Stargardt+phenotype+in+Abca4+knockout+mice+through+inhibition+of+vitamin+A+dimerization.">Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).</li><li>GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blindness+and+Vision+Impairment+Collaborators.+Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years,+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020:+the+Right+to+Sight:+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li></ol>

Aucune divulgation.

Ce protocole fournit une méthode pour étiqueter, imager et quantifier efficacement les dépôts lipidiques dans des modèles de maladies in vitro monogéniques et polygéniques pour les maladies oculaires dégénératives. Le logiciel basé sur l’IA, LipidUNet, peut être appliqué à trois marqueurs lipidiques courants, APOE, Nile Red et BODIPY, et fournit une méthode d’analyse rapide et automatique qui permet à la quantification d’être standard et impartiale.
La principale limitation de LipidUNet est le fait que l’ensemble de données d’apprentissage pour l’IA était limité à des images de grossissement 40x de cellules cultivées dans une plaque de 96 puits. À la suite de l’ensemble d’images d’apprentissage, LipidUNet, dans sa forme actuelle, est limité à l’analyse d’images d’agrandissement 40x. Le logiciel peut être utilisé pour analyser des images 40x de cellules cultivées sur d’autres surfaces de culture en plus d’une plaque de 96 puits, mais il faut prendre soin d’examiner les masques de sortie générés pour vérifier le seuillage précis par le logiciel. Plus d’ensembles d’images (à différents grossissements) seront nécessaires pour élargir la portée des échantillons/images qu’il peut analyser.
Le protocole comporte plusieurs étapes critiques. À l’étape du marqueur lipidique, l’utilisateur doit confirmer que le composé de marquage choisi (BODIPY, APOE, Nile Red) a marqué efficacement son échantillon. Les cellules EPR matures sont souvent fortement pigmentées, ce qui peut altérer le signal fluorescent de l’immunomarquage des anticorps. Lorsque le signal de fluorescence est faible ou lorsqu’il y a trop de coloration de fond, LipidUNet ne peut pas discerner les gouttelettes lipidiques avec précision. Pour une raison similaire, des paramètres d’acquisition correctement sélectionnés pour l’étape d’imagerie automatique du protocole doivent être utilisés. Si les images acquises sont de mauvaise qualité, LipidUNet aura du mal à masquer correctement les images et, par conséquent, la quantification sera inexacte (Figure 6A-L). Enfin, le post-traitement des images est une étape importante, car LipidUNet a des exigences spécifiques pour que le logiciel fonctionne.
Par rapport aux flux de travail pour l’analyse des lipides qui utilisent le seuillage manuel, ou aux techniques qui impliquent un seuillage automatique dans des logiciels comme Fiji, LipidUNet offre une segmentation non biaisée et fiable entre les images avec un dépôt lipidique variable, comme en témoigne un faible taux d’erreur dans l’identification des particules lipidiques (Figure 7). Le logiciel permet à l’utilisateur d’entrer des images d’entraînement supplémentaires, permettant l’analyse d’ensembles d’images au-delà de celles qui utilisent un objectif de grossissement 40x ou même celles qui utilisent un marqueur lipidique différent, comme indiqué dans le protocole. À l’avenir, le logiciel sera formé pour analyser des images 3D afin de permettre la quantification du volume de dépôt lipidique. Les maladies oculaires dégénératives qui impliquent les dépôts de lipides comme un contributeur majeur à la pathologie sont répandues, et les cas devraient augmenter à mesure que la population âgée augmente13. Des modèles de maladie précis et des outils d’analyse efficaces, comme nous l’avons souligné dans ce protocole, permettront le développement de nouvelles interventions thérapeutiques.

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche de cellules située à l’arrière de l’œil adjacente aux photorécepteurs rétiniens. L’EPR joue un rôle essentiel dans le maintien d’une bonne vision en fournissant un soutien métabolique et structurel aux photorécepteurs. Les cellules RPE saines sont caractérisées par une morphologie hexagonale distincte. Ils sont reliés par des jonctions serrées, ce qui permet à l’EPR d’agir comme une barrière entre le choriocapillaris situé sur sa face basale et les photorécepteurs situés apicalement. Pour maintenir l’écosystème rétinien, l’EPR transporte des métabolites clés, par exemple le glucose, vers les photorécepteurs de manière à minimiser la consommation de glucose dans l’EPR1. En raison de cette limitation, l’EPR dépend d’autres métabolites pour maintenir leurs besoins métaboliques, y compris les acides gras, que l’EPR convertit en cétones par β-oxydation2. Compte tenu de la propension de l’EPR à utiliser les acides gras, qui sont probablement recyclés à partir de la digestion du segment externe des photorécepteurs (POS), comme source d’énergie, les changements préjudiciables aux voies de traitement des lipides dans l’EPR conduisent souvent à des maladies dégénératives rétiniennes monogéniques et polygéniques3.
La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), une maladie oculaire dégénérative polygénique qui provoque la dégénérescence de l’EPR, a également été liée à une autophagie aberrante et au métabolisme des lipides dans la monocouche de l’EPR. L’échec d’une monocouche RPE dysfonctionnelle à traiter le POS et à remplir d’autres fonctions critiques conduit à des dépôts extracellulaires (sous-RPE) appelés dépôts linéaires basaux (BLinD) situés entre l’EPR et la membrane de Bruch - une caractéristique des pathologies de la DMLA. Les principaux composants de BLinD comprennent les lipoprotéines, dont la plus abondante est l’apolipoprotéine E (APOE)4. L’accumulation de couches minces de BLinD peut conduire à des drusen mous, qui sont reconnus comme un symptôme clinique de la DMLA 5,6.
Plusieurs groupes ont montré que les modèles de maladies in vitro dérivés de cellules souches qui causent un dysfonctionnement de l’EPR présentent une accumulation lipidique inférieureà l’EPR 7,8,9. Hallam et coll. (2017) ont généré une EPR induite dérivée de cellules souches pluripotentes (iRPE) chez des patients présentant un risque élevé de DMLA en raison d’un polymorphisme du gène ZH. L’iRPE a montré une accumulation de drusen, marquée par l’APOE, et l’EPR à haut risque a accumulé des dépôts plus importants que l’iRPE générée par les patients à faible risque10.
Pour créer un modèle in vitro qui récapitule les caractéristiques cellulaires de la DMLA, telles que les gouttelettes lipidiques et le dépôt de drusen, des lignées iRPE générées à partir d’échantillons de sang de patients ont été établies à l’aide d’un protocole guidé par le développement11 publié précédemment. Les iRPE ont été soumis au sérum humain à complément compétent (CC-HS), une solution contenant des anaphylatoxines qui imitent une cause possible de DMLA : augmentation de la signalisation alternativedu complément 8. Le dépôt cellulaire et sous-cellulaire résultant des dépôts lipidiques a été mesuré à l’aide de marqueurs lipidiques et lipoprotéiques couramment utilisés, APOE, Nile Red et BODIPY. Grâce à ces marqueurs, il a été démontré que la signalisation activée du complément via CC-HS exacerbait l’accumulation de lipides dans les cellules iRPE8.
Pour développer un modèle de maladie pour une maladie dégénérative rétinienne monogénique, des lignées iRPE ont été développées à partir de patients atteints de la maladie de Stargardt, une maladie causée par des mutations du gène ABCA4 dans l’EPR. Il a déjà été démontré que lorsque ABCA4 est éliminé, la lipofuscine A2E, un dépôt intracellulaire connu pour contenir des niveaux élevés de phospholipides et de produits de peroxydation lipidiques dépendants de la lumière, s’accumule à l’intérieur de l’EPR12. Les lignes knockout ABCA4 ont été développées parallèlement aux lignes de patients, et les deux ont été soumises à une alimentation POS. L’iRPE de Stargardt a démontré une pathologie induite par la phagocytose POS, présentant une accumulation accrue de lipides quantifiée par la coloration BODIPY. L’EPR dérivé des CSPi ABCA4 KO a été soumis à un traitement CC-HS; la quantification du signal BODIPY a également montré un défaut dans la manipulation des lipides dans le modèle de la maladie de Stargardt9.
Compte tenu de la prévalence de ces maladies et de la nécessité de mettre en place des traitements efficaces, ainsi que des modèles de maladies pertinents décrits ci-dessus, il est nécessaire d’établir des méthodes robustes pour quantifier l’efficacité des traitements potentiels. Pour quantifier les dépôts lipidiques de manière objective, automatisée et standardisée, un logiciel basé sur l’apprentissage automatique, LipidUNet, a été créé afin que, lorsqu’il est associé à des outils d’analyse de masque, les dépôts lipidiques puissent être identifiés rapidement et efficacement à l’aide des marqueurs communs Nile Red, BODIPY et APOE. Les statistiques sommaires obtenues à l’aide de ce pipeline d’analyse peuvent ensuite être analysées et affichées graphiquement, ce qui permet de comparer facilement les conditions de traitement. Le schéma du protocole est illustré à la figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma du protocole : Les cellules EPR sont cultivées sur une plaque de 96 puits et mises au défi avec du sérum humain actif ou des segments externes bovins purifiés pour modéliser différents types de dégénérescence rétinienne in vitro. Les cellules EPR sont fixées et colorées pour les dépôts de lipoprotéines avec Nile Red, BODIPY et APOE. Un microscope confocal est utilisé pour acquérir des piles Z de particules lipidiques marquées par fluorescence, qui sont ensuite transformées en projections d’intensité maximale 2D. Un algorithme d’apprentissage automatique a été formé pour reconnaître et segmenter correctement les particules de lipoprotéines. Des tableaux récapitulatifs contenant le nombre de particules et diverses mesures de forme sont générés et peuvent être utilisés pour le traçage ultérieur et l’analyse statistique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Steriflip filter system</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine, Fraction V</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>160069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21431</td>
			<td>APOE secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOE primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complement competent human serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1-LITER</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A13707-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Slide mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71870-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Alpha</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72485-100MG</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rod Outer Segments (OS)</td>
			<td>InVision Bioresources</td>
			<td>98740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Ultrapure</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14701SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidunet-machine learning-based method of characterization and quantification of lipid deposits using ipsc-derived retinal pigment epithelium

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche de cellules hexagonales située à l’arrière de l’œil. Il nourrit et soutient les photorécepteurs et les capillaires choroïdiens, effectue une phagocytose des segments externes des photorécepteurs (POS) et sécrète des cytokines de manière polarisée pour maintenir l’homéostasie de la rétine externe. L’EPR dysfonctionnelle, causée par des mutations, le vieillissement et des facteurs environnementaux, entraîne la dégénérescence d’autres couches rétiniennes et entraîne une perte de vision. Une caractéristique phénotypique caractéristique de la dégénérescence de l’EPR est les dépôts intra et subcellulaires riches en lipides. Ces dépôts sont un phénotype commun à différentes maladies dégénératives de la rétine. Pour reproduire le phénotype de dépôt lipidique des dégénérescences rétiniennes monogéniques in vitro, un EPR induit dérivé de cellules souches pluripotentes (iRPE) a été généré à partir des fibroblastes des patients. Les lignées cellulaires générées par des patients atteints de Stargardt et de dégénérescence rétinienne tardive (L-ORD) ont été nourries avec POS pendant 7 jours pour reproduire la fonction physiologique RPE, ce qui a provoqué une pathologie induite par la phagocytose POS dans ces maladies. Pour générer un modèle de dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), une maladie polygénique associée à une activation alternative du complément, l’iRPE a été mis au défi avec d’autres anaphylatoxines du complément. Les dépôts lipidiques intra et subcellulaires ont été caractérisés à l’aide de rouge de Nil, de bore-dipyrrométène (BODIPY) et d’apolipoprotéine E (APOE). Pour quantifier la densité des dépôts lipidiques, un logiciel basé sur l’apprentissage automatique, LipidUNet, a été développé. Le logiciel a été formé sur des images de projection d’intensité maximale d’iRPE sur des surfaces de culture. À l’avenir, il sera formé pour analyser des images tridimensionnelles (3D) et quantifier le volume de gouttelettes lipidiques. Le logiciel LipidUNet sera une ressource précieuse pour découvrir des médicaments qui diminuent l’accumulation de lipides dans les modèles de maladies.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of cells located in the back of the eye adjacent to retinal photoreceptors. RPE plays a vital role in maintaining proper vision by providing metabolic and structural support to the photoreceptors. Healthy RPE cells are characterized by a distinct hexagonal morphology. They are connected by tight junctions, which allow the RPE to act as a barrier between the choriocapillaris located on its basal side and photoreceptors located apically. To maintain the retinal ecosystem, RPE shuttles key metabolites, e.g., glucose, to photoreceptors in a way that minimizes glucose consumption in the RPE1. Due to this limitation, RPE depends on other metabolites to maintain their metabolic needs, including fatty acids, which RPE converts to ketones through &#946;-oxidation2. Given the propensity of RPE to utilize fatty acids, which are likely recycled from photoreceptor outer segment (POS) digestion, as an energy source, detrimental changes to the lipid processing pathways in RPE often lead to, or are implicated in, both monogenic and polygenic degenerative retinal diseases3.
Age-related macular degeneration (AMD), a polygenic degenerative eye disease that causes RPE degeneration, has also been linked to aberrant autophagy and lipid metabolism in the RPE monolayer. The failure of a dysfunctional RPE monolayer to process POS and perform other critical functions leads to extracellular (sub-RPE) deposits called basal linear deposits (BLinD) located between the RPE and Bruch&#39;s membrane - a hallmark of AMD pathologies. Major components of BLinD include lipoproteins, the most abundant of which is apolipoprotein E (APOE)4. Accumulation of thin layers of BLinD can lead to soft drusen, which is recognized as a clinical symptom of AMD5,6.
Several groups have shown that stem cell-derived in vitro disease models that cause RPE dysfunction feature sub-RPE lipid accumulation7,8,9. Hallam et al. (2017) generated induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) from patients with a high risk for AMD due to a polymorphism of the CFH gene. The iRPE showed drusen accumulation, as marked by APOE, and the high-risk RPE accumulated larger deposits than iRPE generated from low-risk patients10.
To create an in vitro model that recapitulates cellular hallmarks of AMD, such as lipid droplets and drusen deposition, iRPE lines generated from patient blood samples were established using a previously published developmentally guided protocol11. The iRPE were subjected to complement-competent human serum (CC-HS), a solution containing anaphylatoxins that mimic one possible cause of AMD: increased alternate complement signaling8. The resulting cellular and sub-cellular deposition of lipid deposits was measured using commonly used lipid and lipoprotein markers, APOE, Nile Red, and&#160;BODIPY. Through these markers, it was shown that activated complement signaling via CC-HS exacerbated lipid accumulation in iRPE cells8.
To develop a disease model for a monogenic retinal degenerative disease, iRPE lines were developed from patients with Stargardt disease, a disease caused by mutations to the ABCA4 gene in RPE. It has previously been shown that when ABCA4 is knocked out, A2E lipofuscin, an intracellular deposit known to contain high levels of phospholipids and light-dependent lipid peroxidation products, accumulates inside the RPE12. ABCA4 knockout lines were developed alongside the patient lines, and both were subjected to POS feeding. The Stargardt iRPE demonstrated POS phagocytosis-induced pathology, exhibiting increased lipid accumulation quantified by BODIPY staining. RPE derived from ABCA4 KO iPSCs were subjected to CC-HS treatment; quantification of the BODIPY signal showed a defect in lipid handling in the Stargardt disease model as well9.
Given the prevalence of these diseases and the need for effective therapeutics, along with the relevant disease models described above, there is a need to establish robust methods for quantifying the efficacy of potential treatments. To quantify lipid deposits in a way that is objective, automated, and standardized, a machine-learning-based software, LipidUNet, was created so that, when paired with mask analysis tools, lipid deposition can quickly and effectively be identified using the common markers Nile Red, BODIPY, and APOE. The summary statistics obtained using this analysis pipeline can then be analyzed and displayed graphically, allowing for easy comparison of treatment conditions. The schematic of the protocol is shown in Figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic of the protocol: RPE cells are grown on a 96-well plate and challenged with active human serum or purified bovine outer segments to model different types of retinal degenerations in vitro. RPE cells are fixed and stained for lipoprotein deposits with Nile Red, BODIPY, and APOE. A confocal microscope is used to acquire Z-stacks of fluorescently-labeled lipid particles, which are subsequently processed into 2D maximum intensity projections. A machine-learning algorithm was trained to recognize and correctly segment lipoprotein particles. Summary tables containing particle count and various shape metrics are generated and can be used for subsequent plotting and statistical analysis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Pleins feux sur l’auteur : Démêler la pathogenèse de la dégénérescence maculaire liée à l’âge et découvrir des thérapies potentielles 

Méthode de caractérisation et de quantification de dépôts lipidiques basée sur l’apprentissage automatique à l’aide d’un épithélium pigmentaire rétinien dérivé d’iPSC

Ce protocole fournit un flux de travail pour identifier les dépôts lipidiques colorés par Nile Red, BODIPY et APOE. Le logiciel développé peut identifier et quantifier automatiquement les dépôts lipidiques et fonctionne mieux lorsque le protocole décrit est optimisé. On y trouve des exemples de RPE différencié avec succès (Figure 3A) et d’EPR peu différencié (Figure 3B), car la qualité du modèle cellulaire a un impact considérable sur la qualité de la segmentation correcte de l’image.
Deux des trois marqueurs décrits dans le protocole, Nile Red et BODIPY, sont identifiés comme de petits points circulaires qui sont nettement lumineux dans les images fluorescentes (Figure 5 et Figure 6). Une image « positive » du protocole serait une identification appropriée de ces dépôts distincts (figure 5A-D et figure 5E-H). Un résultat « négatif » montrerait une segmentation incorrecte de l’image en confondant la fluorescence de fond avec un dépôt, soit en raison d’une faible coloration (Figure 6A-C et Figure 6D-F), soit en raison d’une intensité de fond élevée (Figure 6G-I).
Les dépôts d’APOE ont une variété de tailles et de formes, apparaissant plus ovales ou irrégulières que les dépôts circulaires de Nile Red et BODIPY. Ces dépôts sont également moins ponctués, et l’intensité du signal peut varier d’un dépôt à l’autre en raison des variations de perméabilisation de l’échantillon. Une identification correcte permettra d’identifier chaque gisement, y compris ceux qui sont moins saturés (Figure 5I-L), tandis qu’une segmentation incorrecte ne détectera pas ces dépôts (Figure 6J-L). Par conséquent, il est important d’optimiser les méthodes de coloration et d’imagerie pour éviter les variations drastiques. Une façon de le faire est de porter une attention particulière aux étapes de perméabilisation de l’échantillon pendant l’immunomarquage. Pour optimiser le signal fluorescent, les cellules peuvent être lysées avant la fixation et l’immunomarquage pour l’APOE, ce qui entraîne une saturation uniforme et une meilleure segmentation des dépôts APOE.
Des images segmentées de cellules mûries sur une plate-forme de culture autre qu’une plaque de 96 puits sont également fournies. Le logiciel LipidUNet a été exécuté sur des images de cellules cultivées sur un transwell, et bien que les dépôts lipidiques soient seuillés, il en va de même pour les pores de la membrane transwell (Figure 6M-O). En raison de la similitude de forme et de taille, le logiciel LipidUNet dans sa forme actuelle masquera à la fois les dépôts lipidiques et les pores transwell sans discernement.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig05.jpg"> Figure 5 : Résultats représentatifs. (A, E, I) Les EPR plaqués 96 puits sont colorés avec une coloration nucléaire Hoechst (bleu) et soit rouge du Nil (magenta), BODIPY (vert) ou APOE (orange) et sont les projections d’intensité maximale d’une pile Z. (B, F, J) Les images d’entrée en niveaux de gris pour le logiciel LipidUNet après traitement d’image. (C,G,K) Masques générés par LipidUNet, où tous les dépôts sont identifiés correctement. (D,H,L) Les contours de chaque particule masquée sont numérotés. Ces étiquettes permettent de connecter chaque particule de l’image à une entrée dans le spread heet avec les données brutes. (A-D) montre la coloration rouge du Nil, et le logiciel est capable de reconnaître les dépôts sur l’arrière-plan avec précision malgré un signal plus faible. (E-H) montre un fort contraste entre le signal BODIPY et l’arrière-plan, ce qui est idéal. LipidUNet identifie correctement chaque dépôt dans l’image. (I-L) montre un signal APOE fort et représente la variabilité de la saturation du signal qui est souvent observée avec cette coloration. Néanmoins, la segmentation des images est capable d’identifier les limites de chaque gisement APOE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig06.jpg"> Figure 6 : Résultats sous-optimaux. (A, D, G, J, M) Les EPR à 96 puits sont colorés avec une coloration nucléaire Hoechst (bleu) et un rouge du Nil (magenta), BODIPY (vert) ou APOE (orange) et sont les projections d’intensité maximale d’une pile Z. (B,E,H,K,N) Les images d’entrée en niveaux de gris pour le logiciel LipidUNet après traitement d’image. (C,F,I,L,O) Les masques incorrects générés par LipidUNet. Les cercles rouges indiquent où le logiciel a mal identifié un dépôt lipidique. (A-C) Le traitement du rouge du Nil est incorrect car le logiciel a identifié la coloration de fond comme un dépôt. Cela peut se produire plus souvent lorsqu’il y a un arrière-plan élevé mais peu de dépôts lipidiques dans l’image. Deux exemples de coloration BODIPY sont montrés : une image de mauvaise qualité due à (D-F) une faible coloration BODIPY et (G - I) un signal BODIPY fort avec un arrière-plan élevé. Dans les deux cas, le logiciel est incapable de distinguer les petits dépôts lipidiques circulaires de l’anneau circulaire de fond entourant le noyau. Bien que la coloration et l’imagerie doivent être optimisées pour éviter ces erreurs, la version la plus récente de LipidUNet est largement améliorée pour ces images. (J-L) Segmentation APOE incorrecte. Comme les dépôts sont plus variables en taille et en saturation du signal, le logiciel a du mal à reconnaître certains dépôts. (M-O) RPE ensemencé sur un transwell et taché de rouge du Nil. Une tranche de la pile Z est montrée ici avec à la fois des dépôts lipidiques rouge du Nil et des pores transwell. Le logiciel est incapable de faire la distinction entre les deux, comme le montre le cercle rouge contenant les pores transwell et la flèche verte pointant vers les dépôts rouge du Nil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig07.jpg"> Figure 7 : Comparaison des outils de masque. (A, B, C) L’EPR plaqué 96 puits avec des quantités variables de dépôts lipidiques est identifié avec le rouge du Nil (rouge). Les images sont masquées à l’aide de trois méthodes de masquage courantes différentes, Find Maxima, Max Entropy et Renyi Entropy, et comparées au masque généré par LipidUNet. L’image originale est accompagnée d’un comptage manuel des dépôts lipidiques, tandis que les masques affichent les comptages prédits par chaque méthode de segmentation. Le taux d’erreur moyen a été calculé pour chaque méthode de segmentation à l’aide de la formule suivante : moyenne[(|Nombre prévu - Dénombrement manuel|/Dénombrement manuel) x 100]. Le masque généré par LipidUNet identifie plus précisément les dépôts lipidiques à travers les images avec un dépôt variable par rapport aux autres méthodes de masquage (taux d’erreur moyens: 23% LipidUnet, 1164% Find Maxima, 851% Entropie Max, 203% Entropie Renyi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composant</td>
			<td>Numéro de chat</td>
			<td>Stock Conc.</td>
			<td>Conc. finale</td>
			<td>Ml</td>
		</tr><tr><td>MEM alpha</td>
			<td>12571-063</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
			<td>500</td>
		</tr><tr><td>Supplément N2</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>NA</td>
			<td>1%</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>FBS inactivé par la chaleur</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>NA</td>
			<td>5%</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>NMEM NEAA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>10mM</td>
			<td>0.01mM</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>100mM</td>
			<td>1mM</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000u/ml</td>
			<td>100U/ml</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Taurine</td>
			<td>T4571</td>
			<td>50 mg/mL</td>
			<td>250ug/ml</td>
			<td>2.5</td>
		</tr><tr><td>Hydrocortisone</td>
			<td>N° H6909</td>
			<td>18,1 mg/L</td>
			<td>20ug/L</td>
			<td>0.553</td>
		</tr><tr><td>T3</td>
			<td>T5516</td>
			<td>20ug/L</td>
			<td>0,013 ug/L</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Volume total, mL</td>
			<td>548.383</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Composition du réactif RPE-MM. Une liste des réactifs et des concentrations optimales pour l’EPR-MM.

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Les maladies oculaires dégénératives qui affectent la couche d’épithélium pigmentaire rétinien de l’œil ont des origines monogéniques et polygéniques. Plusieurs modèles de maladies et une application logicielle, LipidUNet, ont été développés pour étudier les mécanismes de la maladie, ainsi que les interventions thérapeutiques potentielles.

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Dans cette étude, nous visons à comprendre la pathogenèse de la macro-dégénérescence liée à l’âge et à trouver le traitement potentiel pour celle-ci. Ce pipeline semi-automatisé pour l’analyse des gouttelettes lipidiques fournit un système robuste pour étudier le métabolisme et les maladies liées au vieillissement. Notre laboratoire se concentre sur la recherche de cibles médicamenteuses pour le traitement de la DMLA, soit à l’aide de criblages génétiques, soit de criblages de petites molécules visant à réduire l’accumulation de dépôts lipidiques.

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LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

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The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to photoreceptors and choroidal capillaries, performs phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS), and secretes cytokines in a polarized manner for maintaining the homeostasis of the outer retina. Dysfunctional RPE, caused by mutations, aging, and environmental factors, results in the degeneration of other retinal layers and causes vision loss. A hallmark phenotypic feature of degenerating RPE is intra and sub-cellular lipid-rich deposits. These deposits are a common phenotype across different retinal degenerative diseases. To reproduce the lipid deposit phenotype of monogenic retinal degenerations in vitro, induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) was generated from patients&#39; fibroblasts. Cell lines generated from patients with Stargardt and Late-onset retinal degeneration (L-ORD) disease were fed with POS for 7 days to replicate RPE physiological function, which caused POS phagocytosis-induced pathology in these diseases. To generate a model for age-related macular degeneration (AMD), a polygenic disease associated with alternate complement activation, iRPE was challenged with alternate complement anaphylatoxins. The intra and sub-cellular lipid deposits were characterized using Nile Red, boron-dipyrromethene (BODIPY), and apolipoprotein E (APOE). To quantify the density of lipid deposits, a machine learning-based software, LipidUNet, was developed. The software was trained on maximum-intensity projection images of iRPE on culture surfaces. In the future, it will be trained to analyze three-dimensional (3D) images and quantify the volume of lipid droplets. The LipidUNet software will be a valuable resource for discovering drugs that decrease lipid accumulation in disease models.

Degenerative eye diseases that affect the retinal pigment epithelium layer of the eye have monogenic and polygenic origins. Several disease models and a software application, LipidUNet, have been developed to study mechanisms of disease, as well as potential therapeutic interventions.