نشكر فالنتينا جريكو على الفئران K14-mCherry-H2B. نحن ممتنون لورشة آلات قسم الفيزياء بجامعة إيموري لتوليد أقراص الغطاء الزجاجي. تم تمويل هذا العمل من قبل جائزة التطوير الوظيفي #IK2 BX005370 من خدمة BLRD التابعة لوزارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكية إلى LS ، وجوائز NIH RF1-AG079269 و R56-AG072473 إلى MJMR ، وجائزة I3 Emory SOM / GT الحاسوبية وتحليل البيانات إلى MJMR.

تم إجراء هذا البحث وفقا لإرشادات رعاية واستخدام بجامعة إيموري والمركز الطبي لشؤون المحاربين القدامى في أتلانتا وتمت الموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC).
1. تركيب ملحق التصوير الحي على مرحلة المجهر المقلوب
<ol><li>قم بإنشاء الإدراج باستخدام ملفات .stl (الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3) مع تحديد الأبعاد ثلاثية الأبعاد والتصميم (انظر الشكل 1 والشكل 2A) وطابعة ثلاثية الأبعاد وحمض polylactic (PLA).</li>
	<li>ضع الإدراج بعناية (الشكل 2B ، C) في أخدود مرحلة المجهر الكبير (الشكل 2C والشكل 3A). استخدم البراغي لتأمين الملحق عبر أربعة ثقوب لولبية موجودة في كل ركن من أركان الملحق (الشكل 2B-C). ملاحظة: الملحق ثنائي الاتجاه ويمكن تدويره 180 درجة حسب اتجاه مرحلة المجهر وجهاز التخدير.</li>
	<li>حرك لوحة التسخين في جانب قابس الإدخال لأسفل (الشكل 2 د) بحيث توضع الوحدة فوق أخاديد الإدخال السفلية مع مرور منفذ التوصيل أسفل المسرح (الشكل 3 ب).</li>
	<li>قم بمحاذاة الفتحة الدائرية المحززة في الملحق بهدف غمر زيت السيليكون 40x (الشكل 3C) وقم بتطبيق زيت السيليكون على مركز الهدف.<ol><li>في حالة التصوير على مدى فترات زمنية أطول (>1 ساعة) ، ضع كمية كبيرة من الزيت الذي سيستمر عند واجهة الغطاء / الهدف طوال التصوير. لا تسمح للزيت بالانسكاب على حواف العدسة.</li>
	</ol></li>
	<li>استخدم حقنة لتطبيق كمية صغيرة من شحم الفراغ على طول الفتحة الدائرية المحززة ووضع قرص غطاء الانزلاق فوقه لإغلاقه على الملحق (الشكل 3 د). ملاحظة: يتم إنشاء قرص الغطاء عن طريق إزالة جدران طبق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي مقاس 35 مم × 10 مم (يتم تنفيذه بواسطة ورشة آلات).</li>
	<li>ارفع الهدف 40x حتى يقبل الزيت الجزء السفلي من الغطاء الزجاجي.</li>
</ol>2. تكوين الأيزوفلوران وإعداد الماوس
<ol><li>ضع مكونات المرذاذ الإلكتروني منخفض التدفق (غرفة التخدير ، الأنبوب ، المرذاذ ، علبة الفحم) للسماح لمخروط الأنف والأنابيب المتصلة بالوصول إلى الملحق (الشكل 3 أ). تنبيه: Isoflurane هو مخدر استنشاق ويجب التعامل معه بحذر لتجنب الانسكابات وتقليل التعرض البشري.</li>
	<li>قم بقياس وزن زجاجة الأيزوفلوران قبل الاستخدام والتسجيل. قم بتوصيل الغطاء من المرذاذ الإلكتروني بزجاجة الأيزوفلوران.</li>
	<li>قم بتوصيل سلك الطاقة بالمبخر الإلكتروني. أغلق مشابك مخروط الأنف الزرقاء وافتح مشابك غرفة الحث البيضاء للسماح بتدفق الهواء عبر الحجرة إلى علبة الفحم. قم بإزالة غطاء الهواء المحيط الأحمر من الجانب الأيسر من الماكينة للسماح بتدفق الهواء.</li>
	<li>اترك النظام يسخن لمدة 5 دقائق عند 200 مل / دقيقة (تدفق منخفض) و 2٪ إيزوفلوران. ملاحظة: على الرغم من تحديد إعداد مخروط الأنف ، يجب أن يظل خط مخروط الأنف الأزرق مغلقا ، ويجب أن يظل خط غرفة الحث الأبيض مفتوحا.</li>
	<li>بمجرد موازنة النظام بشكل صحيح ، قم بتطهير الخطوط لإزالة الأيزوفلوران المتبقي من الغرفة.</li>
	<li>ضع الماوس في غرفة الحث وحدد التدفق العالي. أكمل جميع تحضيرات الماوس (أي إزالة الشعر ، وتوصيل الدواء الموضعي ، وتطبيق مرهم العين ، وما إلى ذلك) قبل وضع جسم فوق الملحق. تأكد من تخدير الماوس بالكامل باستخدام طريقة منعكس قرصة إصبع القدم.<ol><li>مع تمديد الساق ، استخدم ظفرا لقرص إصبع القدم بإحكام دون التسبب في أضرار جسدية. إذا أظهر الفأر رد فعل إيجابي على التحفيز (أي تراجع الساق ، ارتعاش القدم ، إلخ) ، استمر في إعطاء مخدر داخل الغرفة حتى لا يلاحظ أي تفاعل. بمجرد تخديره بشكل مناسب ، يجب أن يتباطأ معدل تنفس الماوس إلى ~ 55-65 نفسا في الدقيقة18.</li>
	</ol></li>
	<li>عندما يتم تخدير الماوس بالكامل ، حدد High Flow مرة أخرى لإيقاف توصيل isoflurane. قم بتطهير الحجرة قبل الفتح واضبط المشابك (أزرق: مفتوح ؛ أبيض: مغلق) لتوصيل الأيزوفلوران عبر مخروط الأنف. حدد التدفق المنخفض أثناء توصيل مخروط الأنف بالماوس لمتابعة توصيل الأيزوفلوران.</li>
	<li>أنبوب إيزوفلوران خيطي مع مخروط الأنف المرفق من خلال قوس أنبوب الزاوية على الملحق (الشكل 3 أ والشكل 5).</li>
</ol>3. وضع الماوس على إدراج للتصوير داخل الجسم
<ol><li>قم بتوصيل لوحة الحرارة بوحدة التحكم (التي تحتوي على مسبار شرجي متصل) ، وقم بتشغيلها ، واترك اللوحة تصل إلى 36 درجة مئوية (الشكل 4 أ).</li>
	<li>قم بإزالة الماوس المخدر من غرفة الحث وضعه عبر لوحة الحرارة (الشكل 4B والشكل 5A). قم بإجراء النقل من الحجرة لإدخالها بسرعة لتقليل الوقت الذي يكون فيه الماوس نشطا دون تخدير استنشاقي.</li>
	<li>ثبت مخروط الأنف على الماوس (الشكل 4B و C والشكل 5). إذا لزم الأمر ، استخدم الشريط اللاصق لمزيد من تأمين زاوية مخروط الأنف وموضعه.</li>
	<li>أدخل المسبار الشرجي واضبط درجة حرارة وحدة التحكم حتى تستقر درجة حرارة جسم الماوس عند ~ 36 °C (الشكل 4A ، B). بعد وضع الماوس بشكل صحيح ، استخدم غلاف بلاستيكي لاحتجاز الحرارة ، إذا لزم الأمر ، لدعم درجة حرارة الجسم المناسبة (الشكل 4C).</li>
	<li>ضع الماوس بحيث يحاذي الرأس قرص غطاء الغطاء وشل حركة الأذن على وسط غطاء الغطاء الزجاجي باستخدام مشبك أذن معدني (الشكل 5 أ ، ب) أو شريط (الشكل 5 ج). ملاحظة: يمكن ضبط ضغط مشبك الأذن المعدني على الأذن عن طريق فك المسمار الذي يثبت المشبك بالإدخال. يمكن إضافة زنبرك معدني لزيادة مرونة شد المشبك.<ol><li>لتغيير موقع مشبك الأذن ، قم بفك البرغي بمفتاح ألين 2.5 مم وانقله إلى الموقع الثانوي (الشكل 2B ، C). عند إعادة تجميع مشبك الأذن ، ضع المشبك مقابل الملحق ، متبوعا بالغسالة في الأعلى. استخدم مسمارا لربط المشبك بإحكام بقوة طفيفة لتدوير المشبك.</li>
	</ol></li>
	<li>اضبط موضع z الموضوعي حتى تصبح الخلايا داخل المكان البؤري (الشكل 6A ، D). قم بتعيين معلمات z-stack والفاصل الزمني وفقا للأهداف التجريبية وابدأ في الحصول على الصور. ملاحظة: إذا تم تحقيق الإعداد الصحيح ، فيمكن تصوير أذن الماوس لمدة 3 ساعات متتالية على الأقل (الشكل 6A '، D').<ol><li>بمجرد تعيين حدود مكدس z ، اضبط طاقة الليزر والكسب لضمان عدم تشبع مستوى z لتقليل التبييض الضوئي. حدد معلمات الفاصل الزمني باستخدام السماكة الكلية لمكدس z وأرقام الخطوات (يوصى بأخذ عينات Nyquist) والفترات الزمنية.</li>
		<li>تحديد معلمات التصوير (الفترات الزمنية ، إجمالي وقت التصوير ، إلخ) باستخدام عوامل متعددة ، بما في ذلك صلاحية تحت التخدير ، والتبييض الضوئي / السمية الضوئية الناجم عن الليزر ، والهدف من التصوير الحي (أي ديناميكيات انقسام الخلايا ، والتفاعلات بين الخلايا والخلايا ، وما إلى ذلك).</li>
	</ol></li>
</ol>4. إنهاء التصوير
<ol><li>قم بتشغيل الوسادة الحرارية التي تدور حول الماء واضبطها على دورة مستمرة و 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل إنهاء التقاط الصورة.</li>
	<li>عند الانتهاء من التصوير ، حدد Low Flow على المرذاذ الإلكتروني لإيقاف توصيل isoflurane وحرك الماوس إلى وسادة حرارية حتى يصبح متنقلا.</li>
	<li>بمجرد الاستيقاظ ، حرك الماوس مرة أخرى إلى حاوية النقل مع الاستمرار في الحفاظ على وسادة حرارية حتى يصبح متنقلا بالكامل. راقب الماوس باستمرار أثناء وجوده على وسادة الحرارة حتى يستجيب.</li>
	<li>على المرذاذ الإلكتروني، انقر فوق تحديد القائمة > التحكم في التخدير > فارغ. قم بإزالة زجاجة الأيزوفلوران من النظام وضع غطاء الشركة المصنعة مرة أخرى على الزجاجة.</li>
	<li>قم بقياس وزن زجاجة الأيزوفلوران وعلبة الفحم وأدخل الأوزان في السجل. بمجرد أن تزن علبة الفحم 50 جم فوق قياس خط الأساس ، تخلص من العلبة واستبدلها بوحدة جديدة. أعد الأيزوفلوران إلى صندوق التأمين.</li>
	<li>قم بإزالة قرص قسيمة الغطاء وامسحه بورق العدسة ومحلول العدسة. تخزينها بشكل صحيح لتجنب الخدوش لإعادة استخدامها.</li>
	<li>قم بإزالة أنبوب التخدير من كتيفة الإدخال وفك الإدخال من مرحلة المجهر.</li>
</ol>

التصوير داخل الجسم باستخدام مجهر مقلوب لتتبع ديناميكيات خلايا الجلد

<ol>
	<li>Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+metastatic+pulmonary+environment.">Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment.</a> Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).</li><li>Nal Chen, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+promote+glioblastoma+tumor+cell+migration+after+biopsy.">Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy.</a> Cells. 11 (14), 2196 (2022).</li><li>Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+study+platelet-leukocyte-endothelial+interactions+in+the+mouse+liver.">Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver.</a> Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).</li><li>Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+imaging+of+breast+cancer.">Multidimensional imaging of breast cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).</li><li>Fischer, M., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+visualize+murine+small+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+migration.">Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration.</a> Current Protocols. 2 (8), (2022).</li><li>Pineda, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+hair+follicle+regeneration+in+the+mouse.">Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).</li><li>Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+to+study+cancer+progression+and+metastasis.">Intravital imaging to study cancer progression and metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).</li><li>Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+techniques+to+image+wound+healing+in+mouse+skin.">Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin.</a> Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).</li><li>Pal Arndt, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+3D+intravital+look+at+the+juxtaglomerular+renin-cell-niche+reveals+an+individual+intra/extraglomerular+feedback+system.">A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system.</a> Frontiers in Physiology. 13, 980787 (2022).</li><li>Oal Yam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+conversion+to+a+tumor-killing+phenotype+underpins+effective+microbial+therapy.">Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy.</a> Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).</li><li>Huang, S., Rompolas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+for+intracutaneous+imaging+of+stem+cell+activity+in+mice.">Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice.</a> Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).</li><li>Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+imaging+depth+of+two-photon+autofluorescence+microscopy+in+epithelial+tissues.">Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).</li><li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology.">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li><li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+between+confocal+and+multiphoton+microscopy+for+rapid+histopathological+evaluation+of+unfixed+human+breast+tissue.">Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).</li><li>Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-induced+cell+death+and+epithelial+phagocytosis+regulate+hair+follicle+stem+cell+pool.">Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool.</a> Nature. 522, 94-97 (2015).</li><li>Ral Li, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+marks+a+cellular+lineage+with+distinct+contributions+to+myofibroblasts+in+lung+maturation+and+injury+response.">Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Tal Tumbar, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin.">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303 (5656), 359-363 (2004).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).</li><li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+microscopy.">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

في هذه الدراسة ، نقدم أداة جديدة تسهل التصوير المستقر والطويل الأمد داخل الجسم لظهارة جلد الفأر السليمة على المجاهر متحدة البؤر المقلوبة. يتكون هذا الاختراع من جيش التحرير الشعبى الصينى, وهو الأكثر شيوعا وغير مكلفة 3D المواد القابلة للطباعة; جميع تكاليف الطباعة ثلاثية الأبعاد الداخلية له?...

الفحص المجهري داخل الجسم هو أداة قوية تسمح بمراقبة سلوكيات الخلايا في بيئاتها غير المضطربة في الجسم الحي. قدمت هذه الطريقة الفريدة رؤى رئيسية حول الأعمال الداخلية لأنظمة أعضاء الثدييات المعقدة ، بما في ذلك الرئة1 والدماغ2 والكبد3 والغدة الثديية4 والأمعاء5 والجلد6. علاوة على ذلك ، كشف هذا النهج عن تغيرات سلوكية للخلايا أثناء تطور الورم7 ، والتئام الجروح 8,9 ، والالتهاب10 ، وغيرها من الأمراض المتنوعة في الموقع. في هذه الدراسة ، نركز على تعزيز إمكانية الوصول إلى الفحص المجهري داخل الجسم لتصوير الديناميكيات الظهارية واللحمية الحية في جلد الفأر السليم. إن فهم سلوكيات الخلايا في جلد الثدييات له أهمية سريرية عالية بسبب القدرة التجديدية والأورام الرائعة لهذا النسيج.
تم إجراء التصوير داخل الجسم في الفئران بشكل أساسي باستخدام المجاهر متعددة الفوتونات المستقيمة نظرا لقدرتها على توفير تصوير عالي الدقة على أعماق الأنسجة >100 ميكرومتر11,12. ومع ذلك ، تفتقر هذه الأدوات إلى تعدد استخدامات العمود الفقري وإمكانية الوصول بشكل عام للمجاهر متحدة البؤر المقلوبة ، والتي تكون أكثر سهولة في الاستخدام وفعالية من حيث التكلفة ، وتوفر القدرة على تصوير الخلايا المستزرعة ، ولا تتطلب ظلاما كاملا أثناء الحصول على الصور ، وهي أكثر أمانا بشكل عام ، من بين مزايا ملحوظة أخرى13,14. في هذه الدراسة ، نقدم أداة جديدة تعزز بشكل كبير إمكانية الوصول إلى التصوير داخل الجسم من خلال تكييف هذا النهج للمجاهر متحدة البؤر المقلوبة.
هنا ، نقدم تصميم إدراج مرحلة مخصص مطبوع ثلاثي الأبعاد يتضمن العديد من الميزات الرئيسية لتسهيل التصوير المستقر والطويل المدى داخل الجسم لجلد أذن الفأر على مجهر متحد البؤر مقلوب (الشكل 1 ، الشكل 2 ، الشكل 3 ، الشكل 4 ، والشكل 5). تتضمن هذه الميزات المتخصصة ثقبا موضوعيا للإزاحة يسمح لجسم الفأر البالغ بالكامل بالاستلقاء تماما أثناء التصوير. هذا يقلل من التداخل الاهتزازي لحركات جسم الفأر على التصوير ويلغي الحاجة إلى إعطاء الكيتامين والزيلازين لتثبيط التنفس ، وهي ممارسة غالبا ما تقترن بالتصوير داخل الجسم6. بالإضافة إلى ذلك ، تضع أقواس الزاوية الموجودة على الملحق مخروط أنف إيزوفلوران بشكل صحيح لمحاذاة وجه الماوس ، ومشبك أذن معدني يجمد أذن الماوس إلى قرص غطاء مصمم خصيصا ، ولوحة حرارية اختيارية مغلقة الحلقة للارتجاع البيولوجي قابلة للفصل تقع داخل الملحق لدعم درجة حرارة جسم الماوس أثناء جلسات التصوير الطويلة. تم إنشاء قرص غطاء مخصص ، والذي يوفر سطحا مستويا ضروريا لرأس الفأر والأذن ليكون مسطحا ، في ورشة آلات عن طريق إزالة جدران طبق زراعة الخلايا العام الذي يحتوي على غطاء الغطاء. يوفر استخدام عدسة غمر زيت السيليكون 40x (فتحة رقمية 1.25 [N.A.] ، مسافة عمل 0.3 مم) جنبا إلى جنب مع قرص غطاء الانزلاق وإدراج المسرح المخصص صورا عالية الدقة >50 ميكرومتر في عمق أدمة الأذن.
لاختبار وظائف إدخال مرحلة المجهر المقلوب الجديد هذا ، التقطنا مداخن z تغطي جميع طبقات ظهارة البشرة على مدار 3 ساعات في أذن فأر بالغ K14-H2B-mCherry15 معدل وراثيا (تحتوي النوى الظهارية في خط الماوس هذا على ملصق فلوري أحمر) (الشكل 6A-A'). لقد التقطنا أيضا مداخن z تمتد على عدة طبقات من الخلايا الليفية داخل الأدمة الجلدية على مدار 3 ساعات في أذن Pdgfra-rtTA16 المعدلة وراثيا الحية. pTRE-H2B-GFP17 فأر بالغ (تحتوي نوى الخلايا الليفية في خط الفأر هذا على ملصق فلوري أخضر بعد تحريض الدوكسيسيكلين) (الشكل 6B-D '). تظهر بياناتنا عالية الدقة استقرارا ثابتا بسبب عدم الانجراف في المستويات x و y و z ، مما يثبت فعالية أداة التصوير الجديدة داخل الجسم هذه للاستخدام على المجاهر المقلوبة. الأهم من ذلك ، يمكن تعديل أبعاد إدراج المرحلة المطبوع ثلاثي الأبعاد ، كما هو موضح في الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3 ، لتناسب أي مجهر مقلوب ، ويمكن نقل موضع الفتحة الموضوعية إلى مواقع بديلة داخل الإدراج لتناسب بشكل أفضل تصوير نسيج معين و / أو نموذج حيواني مهم. وبالتالي يمكن لهذا الاختراع أن يمكن المختبرات الفردية ، أو الباحثين الذين لديهم وصول متحد البؤر للمنشأة الأساسية ، من تكييف هذه الأداة مع احتياجات التصوير الفريدة داخل الجسم الحيوي ، وبالتالي تبسيط تقييم بيولوجيا الخلية المتنوعة في الجسم الحي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer</td>
			<td>Qudi Tech</td>
			<td>i-Fast</td>
			<td>3D prints using PLA material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x 1.25NA silicone objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxR Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Swab</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76337-046</td>
			<td>Cream/ointment application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flathead Screwdriver (2.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Affiix insert to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flathead Screws x 4 (#6-32)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Screw insert into microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Culture Dish</td>
			<td>chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1811-002</td>
			<td>Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Plate controller</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>TCAT-2LV</td>
			<td>Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Wrench (1.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For M3 setscrew adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Wrench (2.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adjust tension on metal ear clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging Insert</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>HPA030782-100uL</td>
			<td>Mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape (or Scotch Tape)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10127-458</td>
			<td>Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal fastener</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>used as ear clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:034459</td>
			<td>Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: K14-H2BPAmCherry</td>
			<td>Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University</td>
			<td></td>
			<td>Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as &#34;K14-H2B-mCherry&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK 
			Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:005104</td>
			<td>&#160;Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Sealing Wrap</td>
			<td>Glad</td>
			<td></td>
			<td>Enhance mouse warmth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MSPP-078932779</td>
			<td>Eye lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screws x 3 (M3; 6 mm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SS3M6</td>
			<td>Attachment for heatplate module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Immersion Oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Applied to 40x silicone objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Heating Plate</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>HP-4M</td>
			<td>Provides heat to animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SF-01</td>
			<td>Mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Grease</td>
			<td>Flinn Scientific</td>
			<td>AP1095</td>
			<td>Seals coverslip disk to insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>hair removal&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water circulating heat pad</td>
			<td>Stryker Medical</td>
			<td>TP700</td>
			<td>for mouse revival post-imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined intravital imaging approach for long-term monitoring of epithelial tissue dynamics on an inverted confocal microscope

يعد فهم السلوكيات الطبيعية والشاذة في الخلايا الحية أمرا ضروريا لتطوير التدخلات السريرية لإحباط بدء المرض وتطوره. لذلك من الأهمية بمكان تحسين مناهج التصوير التي تسهل مراقبة ديناميكيات الخلايا في الموقع ، حيث تظل بنية الأنسجة وتكوينها غير مضطربة. البشرة هي الحاجز الخارجي للجسم ، وكذلك مصدر السرطانات البشرية الأكثر انتشارا ، وهي سرطان الجلد الجلدي. توفر إمكانية الوصول إلى أنسجة الجلد فرصة فريدة لمراقبة سلوكيات الخلايا الظهارية والجلدية في السليمة باستخدام الفحص المجهري داخل الجسم غير الباضع. ومع ذلك ، فقد تم تحقيق نهج التصوير المتطور هذا في المقام الأول باستخدام المجاهر متعددة الفوتونات المستقيمة ، والتي تمثل حاجزا كبيرا أمام دخول معظم الباحثين. تقدم هذه الدراسة مجهرا مصمما خصيصا ، مطبوعا 3D ، مناسبا للاستخدام مع المجاهر متحدة البؤر المقلوبة ، مما يبسط التصوير داخل الجسم على المدى الطويل لجلد الأذن في الفئران المعدلة وراثيا الحية. نعتقد أن هذا الاختراع متعدد الاستخدامات ، والذي يمكن تخصيصه ليناسب العلامة التجارية للمجهر المقلوب والنموذج المفضل وتكييفه مع أنظمة الأعضاء الإضافية للصورة ، سيثبت أنه لا يقدر بثمن لمجتمع البحث العلمي الأكبر من خلال تعزيز إمكانية الوصول إلى الفحص المجهري داخل الجسم بشكل كبير. هذا التقدم التكنولوجي أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا لديناميكيات الخلايا الحية في السياقات الطبيعية والمرضية.

Intravital microscopy is a powerful tool that allows the monitoring of cell behaviors in their unperturbed in vivo environments. This unique method has provided key insights into the inner workings of complex mammalian organ systems, including the lung1, brain2, liver3, mammary gland4, intestine5, and skin6. Furthermore, this approach has revealed cell behavioral alterations during tumor development7, wound healing8,9, inflammation10, and other diverse pathologies in situ. In this study, we focus on enhancing the accessibility of intravital microscopy to image live epithelial and stromal dynamics in intact mouse skin. Understanding cell behaviors in mammalian skin is of high clinical importance due to the remarkable regenerative and tumorigenic capacity of this tissue.
Intravital imaging in mice has&#160;been primarily performed using upright multiphoton microscopes due to their ability to provide high-resolution imaging at tissue depths &#62;100 &#181;m11,12. Nevertheless, these instruments&#160;lack the workhorse versatility and more general accessibility of inverted confocal microscopes, which are more user-friendly and cost-effective, provide the ability to image cultured cells, do not require complete darkness during image acquisition, and are generally safer, among other notable advantages13,14. In this study, we present a new tool that significantly enhances intravital imaging accessibility by adapting this approach for inverted confocal microscopes.
Here, we present a 3D-printed custom stage insert design that incorporates several key features to facilitate stable, long-term intravital imaging of mouse ear skin on an inverted confocal microscope (Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4, and Figure 5). These specialized features include an offset objective hole that allows the full body of an adult mouse to lay entirely flat during imaging. This minimizes the vibrational interference of mouse body movements on imaging and eliminates the need to administer ketamine and xylazine to dampen breathing, a practice often coupled with intravital imaging6. In addition, corner brackets on the insert correctly position an isoflurane nose cone to align with the face of the mouse, a metal ear clip immobilizes the mouse ear to a custom-built coverslip disk, and an optional detachable closed-loop biofeedback heat plate lies flush within the insert to support the mouse body temperature during long imaging sessions. The custom coverslip disk, which provides a flat surface essential for the mouse head and ear to lay flat, was generated in a machine shop by removing the walls of a generic coverslip-containing cell culture dish. The use of a 40x silicone oil immersion lens (1.25 numerical aperture [N.A.], 0.3 mm working distance) in conjunction with the coverslip disk and custom stage insert provides high resolution images &#62;50 &#181;m deep into the ear dermis.
To test the functionality of this new inverted microscope stage insert, we captured z-stacks spanning all epidermal epithelial layers over a 3 h time course in the ear of a live transgenic K14-H2B-mCherry15 adult mouse (epithelial nuclei in this mouse line contain a red fluorescent label) (Figure 6A-A&#39;). We also captured z-stacks spanning several fibroblast layers within the skin dermis over a 3 h time course in the ear of a live transgenic Pdgfra-rtTA16; pTRE-H2B-GFP17 adult mouse (fibroblast nuclei in this mouse line contain a green fluorescent label following doxycycline induction) (Figure 6B-D&#39;). Our high-resolution data demonstrate consistent stability by lack of drift in the x-, y-, and z-planes, thus proving the effectiveness of this new intravital imaging tool for use on inverted microscopes. Importantly, the dimensions of this 3D-printed stage insert can be adjusted, as described in Supplementary File 1, Supplementary File 2, and Supplementary File&#160;3, to fit any inverted microscope, and the positioning of the objective opening can be moved to alternative locations within the insert to better suit imaging a particular tissue and/or animal model of interest. This invention can thus empower individual laboratories, or investigators with core facility confocal access, to adapt this tool for their unique intravital imaging needs, thereby streamlining evaluation of diverse in vivo cell biology.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير أداة لاستخدام المجاهر متحدة البؤر المقلوبة للتصوير داخل الجسم الحي 

نهج التصوير داخل الجسم المبسط للمراقبة طويلة المدى لديناميكيات الأنسجة الظهارية على مجهر متحد البؤر مقلوب

We developed a tool to perform intravital imaging on live mice using an inverted confocal microscope. This enables us to track skin cell dynamics throughout homeostasis and compare cell behaviors during disease onset and progression. Multiphoton microscopy is the primary approach applied to achieve intravital cell tracking.However, the disadvantages of these microscopes include limited day-to-day imaging versatility, high cost, and technical complexity. Our new tool enables the use of versatile inverted confocal microscopes for in vivo intravital imaging. By modifying the design file, the stage insert dimensions can be customized to fit any make of inverted microscope.The objective hole can be resized and repositioned to fit any animal model and tissue of choice.

يتم التحقق من صحة التجميع الصحيح لإدراج التصوير الحي على مجهر متحد البؤر مقلوب والاتجاه المناسب للماوس المعدل وراثيا فوق الملحق من خلال الحصول على أكوام z من أنسجة الأذن الحية ذات العلامات الفلورية على مدار فترة زمنية ≥1 ساعة مع الحد الأدنى من الأدلة على الانجراف في المحاور x و y و z. يجب الت...

Watch this Scientific Journal Video about Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging at JoVE.com

يقدم البروتوكول أداة جديدة لتبسيط التصوير داخل الجسم باستخدام المجهر المقلوب متحد البؤر.

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

قمنا بتطوير أداة لإجراء التصوير داخل الجسم على الفئران الحية باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب. يتيح لنا ذلك تتبع ديناميكيات خلايا الجلد خلال الاتزان الداخلي ومقارنة سلوكيات الخلايا أثناء ظهور المرض وتطوره. الفحص المجهري متعدد الفوتونات هو النهج الأساسي المطبق لتحقيق تتبع الخلايا داخل الجسم.ومع ذلك ، فإن عيوب هذه المجاهر تشمل تعدد استخدامات التصوير اليومية المحدودة ، والتكلفة العالية ، والتعقيد التقني. تتيح أداتنا الجديدة استخدام المجاهر متحدة البؤر المقلوبة متعددة الاستخدامات للتصوير داخل الجسم الحي. من خلال تعديل ملف التصميم ، يمكن تخصيص أبعاد إدراج المرحلة لتناسب أي نوع من المجهر المقلوب.يمكن تغيير حجم الثقب الموضوعي وإعادة وضعه ليناسب أي نموذج حيواني ونسيج من اختياره.

streamlined-intravital-imaging-approach-for-long-term-monitoring

Research

JoVE Journal

Biology

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

1.1K Views.  Emory University School of Medicine. قمنا بتطوير أداة لإجراء التصوير داخل الجسم على الفئران الحية باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب. يتيح لنا ذلك تتبع ديناميكيات خلايا الجلد خلال الاتزان الداخلي ومقارنة سلوكيات الخلايا أثناء ظهور المرض وتطوره. الفحص المجهري متعدد الفوتونات هو النهج الأساسي المطبق لتحقيق تتبع ?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تطوير أداة لاستخدام المجاهر متحدة البؤر المقلوبة للتصوير داخل الجسم الحي 

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It is therefore critical to optimize imaging approaches that facilitate the observation of cell dynamics in situ, where tissue structure and composition remain unperturbed. The epidermis is the body&#39;s outermost barrier, as well as the source of the most prevalent human cancers, namely cutaneous skin carcinomas. The accessibility of skin tissue presents a unique opportunity to monitor epithelial and dermal cell behaviors in intact animals using noninvasive intravital microscopy. Nevertheless, this sophisticated imaging approach has primarily been achieved using upright multiphoton microscopes, which represent a significant barrier for entry for most investigators. This study presents a custom-designed, 3D-printed microscope stage insert suitable for use with inverted confocal microscopes, streamlining the long-term intravital imaging of ear skin in live transgenic mice. We believe this versatile invention, which may be customized to fit the inverted microscope brand and model of choice and adapted to image additional organ systems, will prove invaluable to the greater scientific research community by significantly enhancing the accessibility of intravital microscopy. This technological advancement is critical for bolstering our understanding of live cell dynamics in normal and disease contexts.

The protocol presents a new tool to simplify intravital imaging using inverted confocal microscopy.

Installing the Live Imaging Insert on an Inverted Microscope Stage

To begin installing the 3D printed live imaging insert on the inverted microscope stage, carefully place the insert into the large microscope stage groove. Using screws, secure each corner of the insert. Slide the heat plate into the side opening of the insert in a plug side down orientation, so the plate lays atop the lower insert grooves with the plug port underneath the stage.Align the grooved circular opening in the insert with a 40 x silicone oil immersion objective and apply silicone oil to the center of the objective. Then using a syringe, apply a small amount of vacuum grease along the grooved circular opening. Lay the cover slip disk on top of the opening to seal it onto the insert.Finally, raise the 40 x objective until it barely touches the bottom of the glass cover slip.

تثبيت ملحق التصوير المباشر على مرحلة المجهر المقلوب

Mounting the Mouse on the Live Imaging Insert for Intravital Imaging

Before placing the anesthetized mouse on the live imaging insert installed on the inverted microscope stage, thread the isoflurane tubing with the attached nose cone through the corner tubing bracket on the insert. After plugging the heat plate into the controller containing an attached anal thermometer probe and switching it on, transfer the anesthetized mouse from the induction chamber onto the heat plate. Then secure the nose cone onto the mouse.Insert the anal probe into the animal and adjust the controller to maintain a stable body temperature of about 36 degrees Celsius. Cover the properly-positioned mouse with a plastic cling wrap to trap body heat and elevate the body temperature. Position the mouse such that its head aligns with the cover slip disc and immobilize its ear onto the center of the glass cover slip using a metal ear clip or tape.After completing imaging, select the Low Flow option on the electronic vaporizer to cease isoflurane delivery. Transfer the mouse to a heating pad until it becomes ambulatory. After removing the cover slip disc, wipe it clean with lens paper and lens solution.Store it properly to avoid scratches for reuse. Next, detach the anesthetic tubing from the insert bracket and unscrew the insert from the microscope stage. The acquired Z-stacks of fluorescently-labeled live mouse ear tissue showed minimal drift in the x, y and z axes over time, validating the custom 3D printed live imaging inserts.The time points from a three hour time lapse movie of the mCherry positive mouse ear epidermal cells of an adult male mouse revealed a single z plane remaining in focus over the extended time. Similar observations were made from another three-hour time lapse movie of GFP positive ear dermal fibroblasts of an adult female mouse.