אנו מודים לוולנטינה גרקו על עכברי K14-mCherry-H2B. אנו אסירי תודה לחנות המכונות של המחלקה לפיזיקה באוניברסיטת אמורי על יצירת דיסקיות כיסוי הזכוכית. עבודה זו מומנה על ידי פרס פיתוח קריירה #IK2 BX005370 מהמחלקה לענייני חיילים משוחררים של ארה"ב BLRD Service ל-LS, פרסי NIH RF1-AG079269 ו-R56-AG072473 ל-MJMR, ופרס I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award ל-MJMR.

מחקר זה בוצע בהתאם להנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אמורי והמרכז הרפואי לענייני חיילים משוחררים באטלנטה ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).
1. התקנת עלון ההדמיה החיה על במת המיקרוסקופ ההפוך
<ol><li>בנה את ההוספה באמצעות קובצי .stl (קובץ משלים 1, קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3) המציינים את הממדים והעיצוב התלת-ממדיים (ראה איור 1 ואיור 2A), מדפסת תלת-ממד וחומצה פולילקטית (PLA).</li>
	<li>הניחו בזהירות את האינסרט (איור 2B,C) בחריץ הגדול של שלב המיקרוסקופ (איור 2C ואיור 3A). השתמשו בברגים כדי לאבטח את האינסרט באמצעות ארבעה חורי ברגים הממוקמים בכל פינה של האינסרט (איור 2B-C). הערה: העלון הוא דו-כיווני וניתן לסובב אותו ב-180° בהתאם לכיוון שלב המיקרוסקופ ומנגנון ההרדמה.</li>
	<li>החליקו את לוחית החום לתוך תקע ההוספה כלפי מטה (איור 2D) כך שהיחידה תניח על גבי חריצי ההוספה התחתונים כשיציאת התקע עוברת מתחת לשלב (איור 3B).</li>
	<li>יישרו את הפתח העגול והמחורץ באינסרט עם יעד טבילה של שמן סיליקון 40x (איור 3C) ומרחו שמן סיליקון על מרכז המטרה.<ol><li>אם ההדמיה נמשכת פרקי זמן ארוכים יותר (>1 שעות), יש למרוח כמות נדיבה של שמן שתישאר בממשק הכיסוי/אובייקטיבי לאורך כל ההדמיה. אין לאפשר לשמן להישפך על קצוות העדשה.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמשו במזרק כדי למרוח כמות קטנה של שומן ואקום לאורך הפתח העגול והמחורץ והניחו את דיסק הכיסוי מעליו כדי לאטום את האינסרט (איור 3D). הערה: דיסק הכיסוי נוצר על ידי הסרת הדפנות של צלחת תרבית תאים בתחתית זכוכית בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ (מבוצעת על ידי חנות מכונות).</li>
	<li>מרימים את המטרה פי 40 עד שהשמן נושק לתחתית מכסה הזכוכית.</li>
</ol>2. תצורת איזופלורן והכנת עכבר
<ol><li>מקם את רכיבי הוופורייזר האלקטרוני בזרימה נמוכה (תא הרדמה, צינורות, וופורייזר, מיכל פחם) כדי לאפשר לקונוס האף ולצינורות המחוברים להגיע לאינסרט (איור 3A). אזהרה: איזופלורן הוא חומר הרדמה באינהלציה ויש לטפל בו בזהירות כדי למנוע שפיכות ולמזער את החשיפה לבני אדם.</li>
	<li>יש למדוד את משקל בקבוק האיזופלורן לפני השימוש ולתושם. חברו את הפקק מהוופורייזר האלקטרוני לבקבוק האיזופלורן.</li>
	<li>חבר את כבל החשמל למכשיר האידוי האלקטרוני. סגרו את אטבי חרוט האף הכחולים ופתחו את אטבי תא האינדוקציה הלבנים כדי לאפשר זרימת אוויר דרך התא לתוך מכל הפחם. הסר את מכסה האוויר האדום מצדה השמאלי של ההתקן כדי לאפשר זרימת אוויר.</li>
	<li>אפשר למערכת להתחמם במשך 5 דקות ב-200 מ"ל/דקה (זרימה נמוכה) ו-2% איזופלורן. הערה: למרות שהגדרת חרוט האף נבחרה, קו חרוט האף הכחול צריך להישאר סגור, וקו תא האינדוקציה הלבן צריך להישאר פתוח.</li>
	<li>ברגע שהמערכת מאוזנת כראוי, נקה את הקווים כדי להסיר את שאריות האיזופלורן מהחדר.</li>
	<li>מקם את העכבר בתא האינדוקציה ובחר זרימה גבוהה. השלם את כל הכנת העכבר (כלומר, הסרת שיער, אספקת תרופות מקומית, מריחת משחת עיניים וכו ') לפני הנחת גוף בעל החיים על גבי העלון. ודא שהעכבר מורדם לחלוטין באמצעות שיטת רפלקס צביטת הבוהן.<ol><li>כאשר הרגל מורחבת, השתמש בציפורן כדי לצבוט בחוזקה את הבוהן מבלי לגרום נזק פיזי. אם העכבר מפגין תגובה חיובית לגירוי (כלומר, נסיגה ברגל, עווית ברגל וכו '), המשך לתת הרדמה בתוך החדר עד שלא נצפתה תגובה. לאחר הרדמה מתאימה, קצב נשימת העכבר צריך להאט ל~ 55-65 נשימות לדקה18.</li>
	</ol></li>
	<li>כאשר העכבר מורדם לחלוטין, בחר שוב זרימה גבוהה כדי לעצור את העברת האיזופלורן. נקו את התא לפני פתיחתו וכווננו את האטבים (כחול: פתוח; לבן: סגור) כדי להעביר איזופלורן דרך חרוט האף. בחר זרימה נמוכה כאשר חרוט האף מחובר לעכבר כדי להמשיך בהעברת איזופלורן.</li>
	<li>צינורות איזופלורן חוט עם חרוט האף המחובר דרך תושבת הצינור הפינתי באינסרט (איור 3A ואיור 5).</li>
</ol>3. מיקום העכבר על העלון לצורך הדמיה תוך חיונית
<ol><li>חברו את פלטת החום לבקר (המכילה בדיקה אנאלית מחוברת), הפעילו אותה ואפשרו לצלחת להגיע לטמפרטורה של 36°C (איור 4A).</li>
	<li>הוציאו את העכבר המרדים מתא האינדוקציה ושכבו על פלטת החום (איור 4B ואיור 5A). בצע את ההעברה מהחדר להחדרה במהירות כדי למזער את הזמן שהעכבר פעיל ללא הרדמה ממסים נדיפים.</li>
	<li>הצמידו את חרוט האף לעכבר (איור 4B,C ואיור 5). במידת הצורך, השתמש בסרט כדי לאבטח עוד יותר את הזווית והמיקום של חרוט האף.</li>
	<li>הכנס את הבדיקה האנאלית וכוונן את טמפרטורת הבקר עד שטמפרטורת גוף העכבר יציבה ב~36 מעלות צלזיוס (איור 4A,B). לאחר שהעכבר ממוקם כראוי, השתמשו בניילון נצמד כדי ללכוד חום, במידת הצורך, כדי לתמוך עוד יותר בטמפרטורת הגוף המתאימה (איור 4C).</li>
	<li>מקם את העכבר כך שהראש יתיישר עם דיסק הכיסוי והכנס את האוזן למרכז מכסה הזכוכית באמצעות אטב אוזניים מתכתי (איור 5A,B) או סרט (איור 5C). הערה: ניתן לכוונן את הלחץ של אטב האוזן המתכתי על האוזן על-ידי שחרור הבורג שמחבר את האטב לעלון. ניתן להוסיף קפיץ מתכת לגמישות הידוק קליפס מוגברת.<ol><li>כדי לשנות את מיקום אטב האוזן, פתחו את הברגת הבורג באמצעות מפתח אלן בקוטר 2.5 מ"מ והעבירו אותו לאתר המשני (איור 2B,C). בעת הרכבה מחדש של אטב האוזן, הניחו את האטב כנגד העלון, ולאחר מכן את מכונת הכביסה מעליו. השתמש בבורג כדי להדק היטב את התפס בכוח קל כדי לסובב את התפס.</li>
	</ol></li>
	<li>התאימו את מיקום ה-z האובייקטיבי עד שהתאים יהיו בתוך מקום המוקד (איור 6A,D). הגדר את הפרמטרים z-stack ו- time-lapse בהתאם למטרות הניסוי והתחל ברכישת תמונה. הערה: אם הושגה ההגדרה הנכונה, ניתן לצלם את אוזן העכבר במשך 3 שעות רצופות לפחות (איור 6A',D).<ol><li>לאחר קביעת גבולות מחסנית z, כוונן את עוצמת הלייזר ואת הרווח כדי להבטיח שאף מישור z אינו רווי יתר על המידה כדי למזער את ההלבנה. קבע את פרמטרי קיטועי הזמן באמצעות העובי הכולל של ערימת z, מספרי צעדים (מומלץ דגימת Nyquist) ומרווחי זמן.</li>
		<li>לקבוע את פרמטרי ההדמיה (מרווחי זמן, זמן הדמיה כולל וכו ') באמצעות גורמים מרובים, כולל כדאיות בעלי חיים תחת הרדמה, הלבנה / פוטוטוקסיות המושרה בלייזר, והמטרה של הדמיה חיה (כלומר, דינמיקה של חלוקת תאים, אינטראקציות תא-תא וכו ').</li>
	</ol></li>
</ol>4. הפסקת הדמיה
<ol><li>הפעל את כרית החום במחזור המים והגדר למחזור רציף ו- 35 ° C למשך 30 דקות לפחות לפני סיום רכישת התמונה.</li>
	<li>בסיום ההדמיה, בחר זרימה נמוכה במכשיר האידוי האלקטרוני כדי לעצור את העברת האיזופלורן ולהעביר את העכבר לכרית חום עד לאמבולטורי.</li>
	<li>לאחר התעוררות, החזירו את העכבר למיכל ההעברה תוך המשך שמירה על כרית חום עד לאמולטורי מלא. נטר באופן עקבי את העכבר בזמן שהוא על כרית החום עד שהוא מגיב.</li>
	<li>במכשיר האידוי האלקטרוני, לחץ על בחר תפריט > בקרת הרדמה > ריק. הסר את בקבוק האיזופלורן מהמערכת והחזיר את פקק היצרן לבקבוק.</li>
	<li>מדדו את משקל בקבוק האיזופלורן ומיכל הפחם והכניסו משקולות לבול עץ. לאחר שמיכל הפחם שוקל 50 גרם מעל המדידה הבסיסית, השליכו את המיכל והחליפו אותו ביחידה חדשה. החזר את האיזופלורן לתיבת הנעילה.</li>
	<li>הסר את דיסק הכיסוי ונגב באמצעות נייר עדשה ותמיסת עדשה. יש לאחסן כראוי כדי למנוע שריטות לשימוש חוזר.</li>
	<li>הסר את צינורית ההרדמה מתושבת ההחדרה ופתח את ההברגה משלב המיקרוסקופ.</li>
</ol>

הדמיה תוך חיונית באמצעות מיקרוסקופ הפוך למעקב אחר דינמיקה של תאי עור

<ol>
	<li>Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+metastatic+pulmonary+environment.">Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment.</a> Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).</li><li>Nal Chen, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+promote+glioblastoma+tumor+cell+migration+after+biopsy.">Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy.</a> Cells. 11 (14), 2196 (2022).</li><li>Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+study+platelet-leukocyte-endothelial+interactions+in+the+mouse+liver.">Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver.</a> Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).</li><li>Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+imaging+of+breast+cancer.">Multidimensional imaging of breast cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).</li><li>Fischer, M., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+visualize+murine+small+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+migration.">Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration.</a> Current Protocols. 2 (8), (2022).</li><li>Pineda, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+hair+follicle+regeneration+in+the+mouse.">Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).</li><li>Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+to+study+cancer+progression+and+metastasis.">Intravital imaging to study cancer progression and metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).</li><li>Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+techniques+to+image+wound+healing+in+mouse+skin.">Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin.</a> Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).</li><li>Pal Arndt, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+3D+intravital+look+at+the+juxtaglomerular+renin-cell-niche+reveals+an+individual+intra/extraglomerular+feedback+system.">A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system.</a> Frontiers in Physiology. 13, 980787 (2022).</li><li>Oal Yam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+conversion+to+a+tumor-killing+phenotype+underpins+effective+microbial+therapy.">Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy.</a> Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).</li><li>Huang, S., Rompolas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+for+intracutaneous+imaging+of+stem+cell+activity+in+mice.">Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice.</a> Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).</li><li>Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+imaging+depth+of+two-photon+autofluorescence+microscopy+in+epithelial+tissues.">Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).</li><li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology.">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li><li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+between+confocal+and+multiphoton+microscopy+for+rapid+histopathological+evaluation+of+unfixed+human+breast+tissue.">Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).</li><li>Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-induced+cell+death+and+epithelial+phagocytosis+regulate+hair+follicle+stem+cell+pool.">Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool.</a> Nature. 522, 94-97 (2015).</li><li>Ral Li, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+marks+a+cellular+lineage+with+distinct+contributions+to+myofibroblasts+in+lung+maturation+and+injury+response.">Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Tal Tumbar, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin.">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303 (5656), 359-363 (2004).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).</li><li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+microscopy.">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

במחקר זה אנו מציגים כלי חדש המאפשר הדמיה תוך-חיונית יציבה וארוכת טווח של אפיתל עור עכבר שלם על גבי מיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים. המצאה זו עשויה PLA, שהוא החומר הנפוץ ביותר וזול ביותר להדפסה תלת מימדית; כל עלויות הדפסת התלת-ממד הפנימיות עבור עלון זה מסתכמות ב-<$5. את שני חלקי ההוספה הנפרדים (<str...

מיקרוסקופיה תוך-חיונית היא כלי רב עוצמה המאפשר ניטור של התנהגויות תאים בסביבות in-vivo שאינן מוטרדות. שיטה ייחודית זו סיפקה תובנות מפתח על פעולתן הפנימית של מערכות איברים מורכבות של יונקים, כולל ריאות1, מוח2, כבד3, בלוטת חלב4, מעי5 ועור6. יתר על כן, גישה זו חשפה שינויים התנהגותיים בתאים במהלך התפתחות הגידול7, ריפוי פצעים8,9, דלקת10, ופתולוגיות מגוונות אחרות באתרן. במחקר זה אנו מתמקדים בשיפור הנגישות של מיקרוסקופ תוך-חיוני לדימוי דינמיקה חיה של אפיתל וסטרומה בעור עכבר שלם. הבנת התנהגויות תאים בעור יונקים היא בעלת חשיבות קלינית גבוהה בשל יכולת ההתחדשות והגידול המדהימה של רקמה זו.
הדמיה תוך-חיונית בעכברים בוצעה בעיקר באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון זקוף בשל יכולתם לספק הדמיה ברזולוציה גבוהה בעומקי רקמות >100 מיקרומטר11,12. עם זאת, מכשירים אלה חסרים את הרבגוניות של סוס העבודה ואת הנגישות הכללית יותר של מיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים, שהם ידידותיים יותר למשתמש וחסכוניים יותר, מספקים את היכולת לצלם תאים בתרבית, אינם דורשים חושך מוחלט במהלך רכישת תמונה, והם בדרך כלל בטוחים יותר, בין יתרונות בולטים אחרים13,14. במחקר זה אנו מציגים כלי חדש המשפר באופן משמעותי את נגישות ההדמיה התוך-חיונית על ידי התאמת גישה זו למיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים.
כאן, אנו מציגים עיצוב של עלון במה מותאם אישית המודפס בתלת-ממד המשלב מספר תכונות עיקריות כדי להקל על הדמיה תוך-חיונית יציבה וארוכת טווח של עור אוזני עכבר במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך (איור 1, איור 2, איור 3, איור 4 ואיור 5). תכונות מיוחדות אלה כוללות חור אובייקטיבי אופסט המאפשר את כל הגוף של עכבר בוגר לשכב שטוח לחלוטין במהלך ההדמיה. זה ממזער את הפרעות הרטט של תנועות גוף העכבר בהדמיה ומבטל את הצורך לתת קטמין וקסילזין כדי לדכא את הנשימה, תרגול שלעתים קרובות משולב עם הדמיה תוך חיונית6. בנוסף, סוגריים פינתיים בעלון ממקמים נכון חרוט אף איזופלורני כדי ליישר קו עם פני העכבר, אטב אוזניים מתכתי משתק את אוזן העכבר לדיסק כיסוי שנבנה בהתאמה אישית, ופלטת חום ביופידבק אופציונלית בלולאה סגורה הניתנת להסרה מונחת בתוך העלון כדי לתמוך בטמפרטורת גוף העכבר במהלך מפגשי הדמיה ארוכים. דיסק הכיסוי המותאם אישית, המספק משטח שטוח החיוני לראש העכבר ולאוזן לשכב שטוחים, נוצר בחנות מכונות על ידי הסרת הדפנות של צלחת תרבית תאים גנרית המכילה כיסוי. השימוש בעדשת טבילה בשמן סיליקון 40x (צמצם מספרי 1.25 [N.A.], מרחק עבודה של 0.3 מ"מ) בשילוב עם דיסק הכיסוי ותוספת הבמה המותאמת אישית מספק תמונות ברזולוציה גבוהה >50 מיקרומטר עמוק לתוך הדרמיס של האוזן.
כדי לבחון את הפונקציונליות של שלב המיקרוסקופ ההפוך החדש הזה, לכדנו ערימות z המשתרעות על פני כל שכבות אפיתל האפידרמיס במהלך זמן של 3 שעות באוזן של עכבר בוגר חי מהונדס K14-H2B-mCherry15 (גרעיני אפיתל בקו העכבר הזה מכילים תווית פלואורסצנטית אדומה) (איור 6A-A'). לכדנו גם ערימות z המשתרעות על פני מספר שכבות פיברובלסטים בתוך דרמיס העור במהלך 3 שעות באוזן של Pdgfra-rtTA16 מהונדס חי; pTRE-H2B-GFP17 עכבר בוגר (גרעיני פיברובלסטים בקו העכבר הזה מכילים תווית פלואורסצנטית ירוקה לאחר השראת דוקסיציקלין) (איור 6B-D'). הנתונים ברזולוציה גבוהה שלנו מראים יציבות עקבית על ידי חוסר סחף במישורי x, y ו- z, ובכך מוכיחים את יעילותו של כלי הדמיה תוך חיוני חדש זה לשימוש במיקרוסקופים הפוכים. חשוב לציין, ניתן להתאים את הממדים של תוספת שלב זו המודפסת בתלת-ממד, כמתואר בקובץ משלים 1, קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3, כך שיתאימו לכל מיקרוסקופ הפוך, וניתן להעביר את מיקום פתח המטרה למיקומים חלופיים בתוך העלון כדי להתאים טוב יותר להדמיית רקמה מסוימת ו/או מודל בעל חיים מעניין. המצאה זו יכולה אפוא להעצים מעבדות בודדות, או חוקרים עם גישה קונפוקלית למתקני הליבה, להתאים כלי זה לצרכי הדימות התוך-חיוניים הייחודיים שלהם, ובכך לייעל את ההערכה של ביולוגיה מגוונת של התא in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer</td>
			<td>Qudi Tech</td>
			<td>i-Fast</td>
			<td>3D prints using PLA material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x 1.25NA silicone objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxR Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Swab</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76337-046</td>
			<td>Cream/ointment application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flathead Screwdriver (2.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Affiix insert to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flathead Screws x 4 (#6-32)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Screw insert into microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Culture Dish</td>
			<td>chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1811-002</td>
			<td>Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Plate controller</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>TCAT-2LV</td>
			<td>Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Wrench (1.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For M3 setscrew adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Wrench (2.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adjust tension on metal ear clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging Insert</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>HPA030782-100uL</td>
			<td>Mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape (or Scotch Tape)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10127-458</td>
			<td>Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal fastener</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>used as ear clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:034459</td>
			<td>Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: K14-H2BPAmCherry</td>
			<td>Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University</td>
			<td></td>
			<td>Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as &#34;K14-H2B-mCherry&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK 
			Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:005104</td>
			<td>&#160;Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Sealing Wrap</td>
			<td>Glad</td>
			<td></td>
			<td>Enhance mouse warmth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MSPP-078932779</td>
			<td>Eye lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screws x 3 (M3; 6 mm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SS3M6</td>
			<td>Attachment for heatplate module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Immersion Oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Applied to 40x silicone objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Heating Plate</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>HP-4M</td>
			<td>Provides heat to animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SF-01</td>
			<td>Mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Grease</td>
			<td>Flinn Scientific</td>
			<td>AP1095</td>
			<td>Seals coverslip disk to insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>hair removal&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water circulating heat pad</td>
			<td>Stryker Medical</td>
			<td>TP700</td>
			<td>for mouse revival post-imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined intravital imaging approach for long-term monitoring of epithelial tissue dynamics on an inverted confocal microscope

הבנת התנהגויות נורמליות וחריגות של תאי in vivo נחוצה לפיתוח התערבויות קליניות לסיכול התחלת המחלה והתקדמותה. לכן חיוני לייעל גישות הדמיה המאפשרות תצפית על דינמיקה של תאים באתרם, כאשר מבנה הרקמה והרכבה נותרים ללא הפרעה. האפידרמיס הוא המחסום החיצוני ביותר של הגוף, כמו גם המקור לסרטן האנושי הנפוץ ביותר, כלומר קרצינומה עורית של העור. הנגישות של רקמת העור מהווה הזדמנות ייחודית לנטר התנהגויות אפיתל ותאי עור בבעלי חיים שלמים באמצעות מיקרוסקופ תוך-חיוני לא פולשני. עם זאת, גישת הדמיה מתוחכמת זו הושגה בעיקר באמצעות מיקרוסקופים רבי-פוטונים זקופים, המהווים חסם כניסה משמעותי עבור רוב החוקרים. מחקר זה מציג עלון במה מותאם אישית למיקרוסקופ מודפס בתלת-ממד המתאים לשימוש עם מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, ומייעל את ההדמיה התוך-חיונית ארוכת הטווח של עור האוזן בעכברים טרנסגניים חיים. אנו מאמינים כי המצאה רב-תכליתית זו, אשר עשויה להיות מותאמת אישית כך שתתאים למותג המיקרוסקופ ההפוך ולדגם המועדף ותותאם לתמונות של מערכות איברים נוספות, תוכיח את עצמה כבעלת ערך רב לקהילת המחקר המדעי הגדולה יותר על ידי שיפור משמעותי של הנגישות של מיקרוסקופיה תוך חיונית. התקדמות טכנולוגית זו היא קריטית לחיזוק הבנתנו את הדינמיקה של תאים חיים בהקשרים נורמליים ומחלות.

Intravital microscopy is a powerful tool that allows the monitoring of cell behaviors in their unperturbed in vivo environments. This unique method has provided key insights into the inner workings of complex mammalian organ systems, including the lung1, brain2, liver3, mammary gland4, intestine5, and skin6. Furthermore, this approach has revealed cell behavioral alterations during tumor development7, wound healing8,9, inflammation10, and other diverse pathologies in situ. In this study, we focus on enhancing the accessibility of intravital microscopy to image live epithelial and stromal dynamics in intact mouse skin. Understanding cell behaviors in mammalian skin is of high clinical importance due to the remarkable regenerative and tumorigenic capacity of this tissue.
Intravital imaging in mice has&#160;been primarily performed using upright multiphoton microscopes due to their ability to provide high-resolution imaging at tissue depths &#62;100 &#181;m11,12. Nevertheless, these instruments&#160;lack the workhorse versatility and more general accessibility of inverted confocal microscopes, which are more user-friendly and cost-effective, provide the ability to image cultured cells, do not require complete darkness during image acquisition, and are generally safer, among other notable advantages13,14. In this study, we present a new tool that significantly enhances intravital imaging accessibility by adapting this approach for inverted confocal microscopes.
Here, we present a 3D-printed custom stage insert design that incorporates several key features to facilitate stable, long-term intravital imaging of mouse ear skin on an inverted confocal microscope (Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4, and Figure 5). These specialized features include an offset objective hole that allows the full body of an adult mouse to lay entirely flat during imaging. This minimizes the vibrational interference of mouse body movements on imaging and eliminates the need to administer ketamine and xylazine to dampen breathing, a practice often coupled with intravital imaging6. In addition, corner brackets on the insert correctly position an isoflurane nose cone to align with the face of the mouse, a metal ear clip immobilizes the mouse ear to a custom-built coverslip disk, and an optional detachable closed-loop biofeedback heat plate lies flush within the insert to support the mouse body temperature during long imaging sessions. The custom coverslip disk, which provides a flat surface essential for the mouse head and ear to lay flat, was generated in a machine shop by removing the walls of a generic coverslip-containing cell culture dish. The use of a 40x silicone oil immersion lens (1.25 numerical aperture [N.A.], 0.3 mm working distance) in conjunction with the coverslip disk and custom stage insert provides high resolution images &#62;50 &#181;m deep into the ear dermis.
To test the functionality of this new inverted microscope stage insert, we captured z-stacks spanning all epidermal epithelial layers over a 3 h time course in the ear of a live transgenic K14-H2B-mCherry15 adult mouse (epithelial nuclei in this mouse line contain a red fluorescent label) (Figure 6A-A&#39;). We also captured z-stacks spanning several fibroblast layers within the skin dermis over a 3 h time course in the ear of a live transgenic Pdgfra-rtTA16; pTRE-H2B-GFP17 adult mouse (fibroblast nuclei in this mouse line contain a green fluorescent label following doxycycline induction) (Figure 6B-D&#39;). Our high-resolution data demonstrate consistent stability by lack of drift in the x-, y-, and z-planes, thus proving the effectiveness of this new intravital imaging tool for use on inverted microscopes. Importantly, the dimensions of this 3D-printed stage insert can be adjusted, as described in Supplementary File 1, Supplementary File 2, and Supplementary File&#160;3, to fit any inverted microscope, and the positioning of the objective opening can be moved to alternative locations within the insert to better suit imaging a particular tissue and/or animal model of interest. This invention can thus empower individual laboratories, or investigators with core facility confocal access, to adapt this tool for their unique intravital imaging needs, thereby streamlining evaluation of diverse in vivo cell biology.

מחבר זרקור: פיתוח כלי לשימוש במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עבור הדמיה תוך-חיונית In Vivo 

גישת הדמיה תוך-חיונית יעילה לניטור ארוך טווח של דינמיקה של רקמת אפיתל במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך

We developed a tool to perform intravital imaging on live mice using an inverted confocal microscope. This enables us to track skin cell dynamics throughout homeostasis and compare cell behaviors during disease onset and progression. Multiphoton microscopy is the primary approach applied to achieve intravital cell tracking.However, the disadvantages of these microscopes include limited day-to-day imaging versatility, high cost, and technical complexity. Our new tool enables the use of versatile inverted confocal microscopes for in vivo intravital imaging. By modifying the design file, the stage insert dimensions can be customized to fit any make of inverted microscope.The objective hole can be resized and repositioned to fit any animal model and tissue of choice.

הרכבה נכונה של עלון הדמיה חיה במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך והתמצאות מתאימה של עכבר מהונדס על גבי העלון מאומתת על ידי רכישת ערימות z של רקמת אוזן חיה עם תווית פלואורסצנטית לאורך מסלול זמן ≥1 שעות עם עדות מינימלית לסחף בצירי x, y ו-z. יש לצלם תמונות במרווחי זמן קבועים (זמן המרווח יהיה תלוי בשאלה הבי...

Watch this Scientific Journal Video about Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging at JoVE.com

הפרוטוקול מציג כלי חדש לפישוט הדמיה תוך חיונית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך.

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

פיתחנו כלי לביצוע הדמיה תוך-חיונית בעכברים חיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך. זה מאפשר לנו לעקוב אחר הדינמיקה של תאי העור במהלך הומאוסטזיס ולהשוות התנהגויות תאים במהלך הופעת המחלה והתקדמותה. מיקרוסקופ מולטיפוטונים הוא הגישה העיקרית המיושמת להשגת מעקב תאים תוך חיוני.עם זאת, החסרונות של מיקרוסקופים אלה כוללים רב-תכליתיות מוגבלת של הדמיה יומיומית, עלות גבוהה ומורכבות טכנית. הכלי החדש שלנו מאפשר שימוש במיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים רב-תכליתיים לדימות תוך-חיוני in vivo. על ידי שינוי קובץ העיצוב, ניתן להתאים אישית את מידות הוספת הבמה כך שיתאימו לכל סוג של מיקרוסקופ הפוך.ניתן לשנות את גודל החור האובייקטיבי ולמקם אותו מחדש כך שיתאים לכל דגם ורקמה לפי בחירתו של בעל חיים.

streamlined-intravital-imaging-approach-for-long-term-monitoring

Research

JoVE Journal

Biology

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

1.1K Views.  Emory University School of Medicine. פיתחנו כלי לביצוע הדמיה תוך-חיונית בעכברים חיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך. זה מאפשר לנו לעקוב אחר הדינמיקה של תאי העור במהלך הומאוסטזיס ולהשוות התנהגויות תאים במהלך הופעת המחלה והתקדמותה. מיקרוסקופ מולטיפוטונים הוא הגישה העיקרית המיושמת להשגת מעקב תאים תוך חיוני.

Video: מחבר זרקור: פיתוח כלי לשימוש במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עבור הדמיה תוך-חיונית In Vivo 

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It is therefore critical to optimize imaging approaches that facilitate the observation of cell dynamics in situ, where tissue structure and composition remain unperturbed. The epidermis is the body&#39;s outermost barrier, as well as the source of the most prevalent human cancers, namely cutaneous skin carcinomas. The accessibility of skin tissue presents a unique opportunity to monitor epithelial and dermal cell behaviors in intact animals using noninvasive intravital microscopy. Nevertheless, this sophisticated imaging approach has primarily been achieved using upright multiphoton microscopes, which represent a significant barrier for entry for most investigators. This study presents a custom-designed, 3D-printed microscope stage insert suitable for use with inverted confocal microscopes, streamlining the long-term intravital imaging of ear skin in live transgenic mice. We believe this versatile invention, which may be customized to fit the inverted microscope brand and model of choice and adapted to image additional organ systems, will prove invaluable to the greater scientific research community by significantly enhancing the accessibility of intravital microscopy. This technological advancement is critical for bolstering our understanding of live cell dynamics in normal and disease contexts.

The protocol presents a new tool to simplify intravital imaging using inverted confocal microscopy.

Installing the Live Imaging Insert on an Inverted Microscope Stage

To begin installing the 3D printed live imaging insert on the inverted microscope stage, carefully place the insert into the large microscope stage groove. Using screws, secure each corner of the insert. Slide the heat plate into the side opening of the insert in a plug side down orientation, so the plate lays atop the lower insert grooves with the plug port underneath the stage.Align the grooved circular opening in the insert with a 40 x silicone oil immersion objective and apply silicone oil to the center of the objective. Then using a syringe, apply a small amount of vacuum grease along the grooved circular opening. Lay the cover slip disk on top of the opening to seal it onto the insert.Finally, raise the 40 x objective until it barely touches the bottom of the glass cover slip.

התקנת עלון הדמיה חיה על במת מיקרוסקופ הפוך

Mounting the Mouse on the Live Imaging Insert for Intravital Imaging

Before placing the anesthetized mouse on the live imaging insert installed on the inverted microscope stage, thread the isoflurane tubing with the attached nose cone through the corner tubing bracket on the insert. After plugging the heat plate into the controller containing an attached anal thermometer probe and switching it on, transfer the anesthetized mouse from the induction chamber onto the heat plate. Then secure the nose cone onto the mouse.Insert the anal probe into the animal and adjust the controller to maintain a stable body temperature of about 36 degrees Celsius. Cover the properly-positioned mouse with a plastic cling wrap to trap body heat and elevate the body temperature. Position the mouse such that its head aligns with the cover slip disc and immobilize its ear onto the center of the glass cover slip using a metal ear clip or tape.After completing imaging, select the Low Flow option on the electronic vaporizer to cease isoflurane delivery. Transfer the mouse to a heating pad until it becomes ambulatory. After removing the cover slip disc, wipe it clean with lens paper and lens solution.Store it properly to avoid scratches for reuse. Next, detach the anesthetic tubing from the insert bracket and unscrew the insert from the microscope stage. The acquired Z-stacks of fluorescently-labeled live mouse ear tissue showed minimal drift in the x, y and z axes over time, validating the custom 3D printed live imaging inserts.The time points from a three hour time lapse movie of the mCherry positive mouse ear epidermal cells of an adult male mouse revealed a single z plane remaining in focus over the extended time. Similar observations were made from another three-hour time lapse movie of GFP positive ear dermal fibroblasts of an adult female mouse.