شكرا ليلي الشمس للحصول على المساعدة الفنية والدكتور كريس Gellynck للتعليقات مفيدة وثلاثة المراجعين المجهولين للحصول على المشورة البناءة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مبادرة التجديد السمع سونيبروك

وقد تحصد الأنسجة الماوس من Sox2 EGFP الفئران -reporter 12 حافظ والموت الرحيم وفقا لمبادئ توجيهية المجلس الكندي للرعاية الحيوان لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. 1. التثقيف الجنينية القوقعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكملة Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) عن طريق خلط 8.89 مل من DMEM، 1 مل من مصل بقري جنيني (FBS)، 100 ميكرولتر من 100X N2 ملحق، و 10 ميكرولتر من 10 ملغ / مل سيبروفلوكساسين. تكملة محلول الملح هانك المتوازن (HBSS) عن طريق خلط 495 مل HBSS مع 5 مل من 100٪ HEPES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أطباق ثقافة أسفل الزجاج: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غطاء تدفق الصفحي، و resuspend 200 ميكرولتر استخراج غشاء الطابق السفلي الركيزة في 5 مل DMEM. إعداد أطباق زجاجية قطرها 35 ملم ثقافة القاع برصيد 10 ملم الآبار. ماصة 150 ميكرولتر الركيزة / DMEM لفي وسط كل الزجاج قاع الطبق. هذه الأطباق يمكن استخدامها بعد 40 دقيقة الحضانة، أو يمكن تخزينها في CO 2 </sub&gt; الحاضنة عند 35 درجة مئوية لمدة أسبوع على الأقل. ملاحظة: يتم استخدام الزجاج القاع أطباق للأسباب التالية: التأكد من أن قاعدة الطبق شفافة ومناسبة للتصوير، لإنشاء بئر في وسط الطبق الذي يسمح للإإكسبلنتس ليستقر في منطقة تقع بسهولة، وأخيرا ذلك أنه بعد تجربة يمكن معالجة المناعية للعينة وتحليلها لاحقا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محطة العمل والأدوات: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على تدفق الصفحي مقاعد البدلاء نظيفة، ورذاذ أسفل مع 70٪ ETOH لخلق مساحة عمل نظيفة. نقع ملقط، ملاعق، والأسود 184 طبق سيليكون المطاط الصناعي (مزيج من السيليكون والمطاط الصناعي 184 (10 أجزاء)، وكيل المعالجة (جزء 1) ومسحوق الفحم (2.5 غرام)) في 70٪ ETOH. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في محطة عمل نظيفة والأجنة حصاد التجربة. جمع الأجنة في الحمل المناسب في الجليد الباردة HBSS تستكمل مع 1٪ HEPES. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد جهاز خارجي أو مرئية من شأنها أن تثبتالنشاط الصحفي وفحص الأجنة باستخدام مجهر ستيريو الفلورسنت. جمع الأجنة التي تظهر النشاط الصحفي في الجليد الباردة HBSS تستكمل مع HEPES 1٪ حيث أن هذه هي موضوع التجربة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع العظام الزمنية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل بسرعة، وذلك باستخدام مصدر ضوء بارد وملقط غرامة، وجمع رؤساء الجراء. الحرص على مقطع في الفقرة العنقية وتحت الفك لتجنب الأضرار التي لحقت العظام الصدغية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح بعناية الجمجمة. إزالة الدماغ، وتقليم قبالة الجزء الأمامي من الرأس، ونقل الجمجمة الخلفي لHBSS الجليد الباردة العذبة تستكمل مع HEPES 1٪ في طبق نظيف. تشريح بعناية والفول السوداني على شكل عظام الزمانية مع الحرص على الحفاظ على النظام الدهليزي في براعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح القوقعة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عظام الزمانية إلى صحن الأسود سيليكون المطاط الصناعي المغلفة في الجليد الباردة HBSS تستكمل مع 1٪ HEPES، دبوس المنطقة الدهليزي من العظام. إدراج دبابيس الحشرات فيزاوية مائلة من أجل تحقيق الاستقرار في العظم الصدغي، وخلق مجال للملقط. التدبيس هو خطوة حاسمة في هذه العملية حيث إذا سمح العظم الصدغي للتحرك كثيرا فمن الصعب جدا أن يحصد أحد القوقعة سليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية الغضاريف المحيطة القوقعة. إدراج طينة واحدة من الملقط في الغضروف في الحافة الخارجية للقاعدة القوقعة ومقطع ثقب في الغضروف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقطع رفرف فوق الجانب، تضاف طينة من الملقط وفصل بلطف سقف القناة من الغضروف. مقطع أفقيا في أعلى وقطريا، ورفع بعناية قبالة الباب الأمامي للكبسولة. إدراج الشق من ملقط بين الغضروف المتبقي والقناة ومقطع بلطف القسم الأخير. يتعرض الآن السطح القمي من القوقعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا من القاعدة، وقبض على المنطقة التي فوق سطح القناة يلبي ظهارة القوقعة وفتح قناة القوقعة. تقشر بلطف السطح، وتقليمعند الضرورة حتى تتم إزالته تماما. تقليم من أي أجزاء من الغشاء المتبقية على الجانب الأنسي من القناة. تنظيف القناة من الأنسجة الزائدة الوسيطة وفصل القناة عن النظام الدهليزي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة إإكسبلنتس: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع يزدرع، اللمعية السطحية تصل، في وسط الركيزة الزجاج المطلي طبق ثقافة القاع، ورسم بعناية قبالة كل من السائل ويترك لمدة دقيقتين. إضافة 150 ميكرولتر DMEM تستكمل إسقاط الحكيم إلى النباتى، مع الحرص على عدم الإخلال به. ينبغي أن يزدرع المرجح بالأسهم الحرة، وتعديل بالملقط، ولكن الحرص على أن يزدرع تستقر في قاع الطبق بحيث يمكن أن نعلق على الركيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أطباق أسفل الزجاج في طبق قطره 12 سم بتري العميق، مع طبق صغير من الماء المعقم للحفاظ على الرطوبة. وضع الثقافات إلى 35 درجة مئوية الحاضنة بين عشية وضحاها من أجل ازدراع لنعلق على الركيزة وتتسطح. </li></ol></li></ol> 2. لايف ايماججي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار العينات يزدرع. استخدام المجهر ستيريو الفلورسنت لتقييم حالة كل من القوقعة explanted. فقط حدد إإكسبلنتس حيث القناة سليمة وتعلق على الزجاج من القاعدة إلى قمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الحاضنة عند 35 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لزراعة الأنسجة قوقعة. وضع الثقافات في حاضنة المجهر: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بلطف قبالة DMEM تستكمل واستبدالها مع لا يقل عن 500 ميكرولتر وسائل الاعلام الطازج. لتصوير ما يصل إلى 6 أيام، 1-1.5 مل هو أفضل. في الحالات التي تعلق إإكسبلنتس فضفاضة، ماصة حلقة من وسائل الإعلام حول حافة الطبق. وهذا السائل الزائد جعل مصغرة &quot;غرفة ترطيب&quot; دون إزعاج يزدرع في حين أنها لا تزال تعلق على المصفوفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، يتوقف استخدام يغطي الطبق لفتح الأغطية بينما يبقى الطبق في تقريرها المناسب في المجهر إذا كانت بحاجة الكواشف التي يتم تبادلها أثناء الفترات الفاصلة بين مجموعات الصور. يغطي الطبق يتوقف تسمح الأغطية لتكونفتحت من دون إزعاج عينات أو إزالة الأطباق من إعداداتها. هذا يحافظ على الموضع الدقيق من أجل يلتقط صورة لاحقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الأطباق الزجاجية القاع التي تحتوي على عينات مناسبة في حامل الطبق العينة. المجهر في هذا المثال يحتوي على منصة دوارة الذي يحمل ثمانية أطباق 35 ملم العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي استبدال الأغطية البلاستيكية ذات الأغطية الزجاجية وإدراج الأطباق في حامل الطبق العينة. وضع حامل الطبق عينة داخل الحاضنة مع الحرص على عدم طرد إإكسبلنتس من قاع الطبق أو أن تخل وسائل الإعلام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد روتين التصوير: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل المجهر، مصباح الأشعة فوق البنفسجية والكاميرا وفتح برامج التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد العينات، واختيار مجال التصوير، وطائرة من التركيز وضبط التعرض مرات لكل طبق في التسلسل. اختيار الطائرة من التركيز ليس فقط اعتمادا على وجهة نظر يزدرع في وقت الانطلاق، ولكن اللهمع الأخذ في الاعتبار كيف ذلك النسيج ستتحرك ومتى سيتم تشغيل مسار الزمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع Z كومة تتمحور حول طائرة التنسيق المحدد في قناة مضان. ضبط تردد وطول أخذ العينات للتجربة. تردد أخذ العينات سيتم محدودة بسبب الوقت الذي يستغرقه لجمع الصور، وحتى هذا ينبغي أن تحدد بعد تحديد المجالات النظر ووضع Z المكدس. في هذه الحالة يأخذ العينات تضع كل 30 دقيقة على مدى خمسة أيام. مدة التجربة يمكن أن تصل إلى 14 يوما. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد فيلم: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية الفترة الفاصل الزمني فتح ملفات الصور. ويستخدم في هذه الحالة البرمجيات Metamorph الذي يفتح نقاط جمع متسلسلة. الإطار من جانب الإطار اختيار أفضل البؤري لإظهار السكان خلية من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل هذه الصور إلى ملف .avi، أو تصديرها كما مونتاج لتوليد مجموعة من الصور التي يمكن فتحها وتحليلها في برامج معالجة الصور أو تحويلها إلى شكلية متعددةTS باستخدام برنامج معالجة الفيديو. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development.">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li><li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auditory+sensory+epithelium:+the+instrument+of+sound+perception.">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li><li>Van de Water, T., Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+inner+ear+in+organ+culture.">Growth of the inner ear in organ culture.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).</li><li>Jacques, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+function+for+canonical+Wnt/beta-catenin+signaling+in+the+developing+mammalian+cochlea.">A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea.</a> Development. 139, 4395-4404 (2012).</li><li>Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+field+laser+confocal+microscopy+for+enhanced+spatial+and+temporal+resolution+in+live-cell+imaging.+Microscopy+and+microanalysis+:+the+official+journal+of+Microscopy.">Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy.</a> Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+increases+fibroblast+growth+factor+receptor+expression+and+disrupts+cell+mechanics+in+the+developing+organ+of+corti.">Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti.</a> BMC developmental biology. 13, 6 (2013).</li><li>Appler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring.">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li><li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry.">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li><li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly(dimethylsiloxane)+microwells+and+time-lapse+imaging.">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li><li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro.">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هناك العديد من النقاط الفنية التي يجب مراعاتها عند إنشاء والثقافات ووضع المجهر مرور الزمن من أجل التصوير على المدى الطويل. نستخدم مصفوفة غشاء الطابق السفلي باعتبارها الركيزة لزراعة قوقعة إإكسبلنتس، ولكن ينبغي أن يقابل الركيزة ?...

القوقعة الثدييات هي جهاز معقد أمر غاية. في الماوس، وبين ظهور الأذن الداخلية البدائية من الحويصلة الأذنية في يوم E11 والانتهاء من البرنامج التنموي في مراحل ما بعد الولادة المبكرة، موجات متعددة من الخلايا مما يشير الى والتغيرات في التعبير الجيني منسقة تحدث. يمتد من القاعدة إلى قمة القناة القوقعة هو صوت كشف ظهارة حسية، أو جهاز كورتي. تطوير جهاز كورتي يتم التحكم بشكل رائع بحيث بنهاية التطوير، وسوف تتكون من صف واحد من خلايا الشعر الداخلية، وثلاثة صفوف من خلايا الشعر الخارجي تتخللها خمسة صفوف من الخلايا الداعمة (صفين من خلايا عمود، ثلاثة صفوف من خلايا دايترس) 1. الانحراف عن هذه النتائج الترتيب الدقيق في فقدان السمع، heighlighting أهمية studye إف تي إتش إي نشأة والزخرفة من epithemlium الحسية 2. زراعة في المختبر من كوتش الفأر الجنينيةليا هي أداة أساسية في دراسة آليات تطوير جهاز كورتي. تأسست هذه التقنية في عام 1974 وعلى مدى السنوات ال 40 الماضية، وقد استخدمت لتوضيح العديد من الآليات التي يتم من خلالها تحديد ظهارة حسية وجهاز كورتي إنشاء 3. القوقعة هي جهاز معقد مع العمليات التنموية الحيوية. تلاعب قد تستغرق وقتا طويلا كما سبعة أيام في إظهار 1. على سبيل المثال، عند إضافة مثبطات 3β GSK لثقافة يزدرع في قوقعة E13، فترة الحضانة المثلى لمراقبة تأثير قوي من المجمع هو ستة أيام 4. التصوير المباشر لتطوير القوقعة يسمح التحقيق في التغييرات في مورفولوجية جهاز كورتي، والتغيرات في التعبير الجيني، وتتبع للهجرة، المتكاثرة أو يموتون الخلايا، وأنه يسمح مراقبة الوقت الحقيقي من نتائج وكلاء الأدوية وتعطل الإشارات مسارات. حتى الآن، والتصوير من القوقعة العيشوقد أجريت أساسا باستخدام متحد البؤر المجهري لصورة مناطق صغيرة من جهاز كورتي على مدى فترات زمنية قصيرة 5-8، ولكن هذه التقنية لديها قيود بسبب قابلية النباتى. في تصوير آثار التلاعب على المدى الطويل على العمليات التنموية بطيئة، والبيئة التصوير أمر بالغ الأهمية. وعادة ما يستخدم نظام التصوير الحي متحد البؤر مربع من البلاستيك مرطب الذي يجلس على المجهر. يمكن للحرارة والرطوبة الهروب من خلال الثغرات في مربع احتضان حيث يلتقي الجدول المجهر، من خلال النوافذ الوصول، من خلال فتحات يتوقف ومن خلال الفجوات حول أجزاء مختلفة من microscope- مثل الهدف أو مصدر الضوء. ليس هذا هو الأمثل للحفاظ على إإكسبلنتس صحية لأكثر من يومين أو ثلاثة أيام. نحدد &quot;المجهر حاضنة &#39;كما مجهر مقلوب مختومة داخل القياسية CO 2 الحاضنة، بدلا من أن تكون حاضنة تتمحور حول المجهر. سابق المجهر الحاضنةيميل إلى الحياة من هذه التجربة بحيث بدلا من التصوير على مدى يومين أو ثلاثة أيام، والعينات ويمكن تصوير لمدة تصل إلى أسبوعين. يوفر المجهر حاضنة بيئة ممتازة لنمو الخلايا والتمايز، مع الحد الأدنى من اضطراب في يزدرع الثقافات والظروف القياسية التي تسيطر عليها. في الدراسات التي تجري على مدى عدة أيام ومن الشائع أن يلجأ إلى عينات التصوير بشكل يومي عن طريق نقلهم من الحاضنة وتحمل لهم المجهر الفلورسنت المقلوب. في حين أن هذا النهج يمكن أن تعمل، وإزالة الأطباق من الحاضنة ينزل الضغط على الأنسجة الحساسة النامي. التغيرات في حموضة المتوسطة زراعة والتقلبات في درجات الحرارة بسبب إزالة من الحاضنة يمكن أن يؤدي إلى تطوير الأمثل والأنسجة غير الصحية. تصوير نفس المنطقة في نفس المستوى البؤري وفي نفس التوجه في كل نقطة زمنية هي صعبة للغاية. باستخدام نظام آلي داخل حاضنة، فمن الممكن للحفاظ على صحة جيدةالأنسجة، لجمع الصور في المزيد من النقاط والوقت لضمان أن يتم التقاط نفس المنطقة في كل إطار. في السنوات الأخيرة تم تطوير عدة حاضنات متكاملة الأنسجة المجهر، وكانت هذه مفيدة ليس فقط في الممارسة السريرية 9 ولكن أيضا في الخلايا الجذعية وأبحاث السرطان 10،11. هنا نقدم بروتوكول للتصوير الحية على المدى الطويل الجنينية إإكسبلنتس الماوس القوقعة. نستخدم نظام المجهر الآلي داخل القياسية CO 2 الحاضنة التي لديها القدرة على التقاط الصور من عينات متعددة في نقطة زمنية محددة. ويتكون النظام من مجهر مقلوب مجموعة داخل حاضنة. توضع العينات في المنصة الدوارة التي تتيح التصوير عينات متعددة في كل نقطة زمنية. يتم التحكم في الإضاءة، والتقاط الصور، وتناوب على المنصة من قبل النظام الآلي تعمل من خلال برنامج Metamorph. عن طريق وضع روتين التصوير باستخدام برنامج التشغيل نتمكن من تجربة لتشغيل لمدة تصل إلى TWس أسابيع مع الحد الأدنى من التدخل البشري. في هذا المثال يمكننا استخدام كل حقل مشرق ومضان لإظهار نمو واسع النطاق وإعادة ترتيب القوقعة، وتحديدا، في المنطقة prosensory. في هذه التجربة، سيتم تشريح قوقعة من Sox2 EGFP الفئران مراسل في يوم الجنينية E13. سيتم تأسيسها في المختبر الثقافات ومن ثم تصويرها على مدى خمسة أيام.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane extract&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. 
			http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5630080</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170161</td>
			<td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. 
			http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&#38;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Size number 5 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&#38;CategoryId=29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curette&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10080-05</td>
			<td>size 1 mm&#160; 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&#38;CategoryId=118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-35</td>
			<td>Must be stainless Steel 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mm plastic dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>charcoal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05105-250G</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>184 silicone elastomer</td>
			<td>Dow/Corning&#160;</td>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>Dishes are home made several weeks in advance.&#160; Silicone elastomer can be from any supplier.<a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291">http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&#160; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. 
			http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&#38;cPath= 1_4_15&#38;products_id=2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>495101-9804-000</td>
			<td>&#160;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Light Source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-182</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Contact Leica microsystems</td>
			<td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Microscope +imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Contact Olympus</td>
			<td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. 
			http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&#38;c=0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51029701</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3310</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026651</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

نحن هنا نقدم وسيلة على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير من حي الجنينية إإكسبلنتس الماوس القوقعة. البرنامج التنموي مسؤولة عن بناء أمر غاية، بنية معقدة من عائدات القوقعة الثديية لنحو عشرة أيام. من أجل دراسة التغيرات في التعبير الجيني خلال هذه الفترة وردهم إلى الأدوية أو التلاعب الجيني، والتصوير طويل الأجل أمر ضروري. سابقا، والتصوير الحي، وعادة ما يحد من قابلية الأنسجة explanted في غرفة ترطيب فوق المجهر العادي. وقد وضعت صعوبة في الحفاظ على الظروف المثلى لنمو الثقافة فيما يتعلق الرطوبة ودرجة الحرارة حدود على طول تجارب التصوير. مجهر دمجها في تعديل حاضنة زراعة الأنسجة ويوفر بيئة ممتازة للتصوير على المدى الطويل الحية. في هذه الطريقة ونحن لشرح كيفية إنشاء الفأر الجنينية إإكسبلنتس القوقعة وكيفية استخدام المجهر حاضنة لإجراء الفاصل الزمني imagiنانوغرام باستخدام كل حقل مشرق والمجهري الفلورسنت لدراسة سلوك نموذجي يوم الجنينية (E) 13 النباتى القوقعة وSox2، علامة من الخلايا prosensory من القوقعة، على مدى 5 أيام.

نحن هنا تظهر المونتاج (الشكل 1) وفيلم (الشكل 2) يدل على كيفية النباتى قوقعة عضوي النمط العادي سوف تنمو إذا مطلي على E13.5. تم استخدام الماوس مراسل Sox2 لتصور المنطقة prosensory. ويوضح الفيلم أن القوقعة يخضع النمو والتقارب والإرشاد، لا يبدو أن الخلايا في ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants at JoVE.com

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

تصوير حي من القوقعة الجنينية لدى الثدييات يمثل تحديا لأن العمليات التنموية في متناول اليد تعمل على التدرج الزمني على مدى عشرة أيام. نحن هنا نقدم وسيلة للزراعة ومن ثم تصوير الأنسجة الجنينية مأخوذة من قوقعة النباتى مراسل الماوس الفلورسنت على مدى خمسة أيام.

على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير من الفأر القوقعة إإكسبلنتس

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

long-term-time-lapse-imaging-of-mouse-cochlear-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K Views.  Sunnybrook Research Institute.  تصوير حي من القوقعة الجنينية لدى الثدييات يمثل تحديا لأن العمليات التنموية في متناول اليد تعمل على التدرج الزمني على مدى عشرة أيام. نحن هنا نقدم وسيلة للزراعة ومن ثم تصوير الأنسجة الجنينية مأخوذة من قوقعة النباتى مراسل الماوس الفلورسنت عل...

Video: Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

متعددة الماوس تشريحي عصبي التصوير بالرنين المغناطيسي

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

الوقت الفاصل بين التصوير حية من خلايا ذات صلة Clonally السلف العصبية في الدماغ المقدم اسماك الزرد النامية

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

مصقول وعززت ضعيفة، جمجمة نافذة على المدى الطويل التصوير من مخ الفأر

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

الوقت الفاصل بين التصوير للهجرة أرومة عصبية في شرائح الدماغ الأمامي الحاد للماوس الكبار

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

محرك عانى من قطع الأعصاب والوقت الفاصل بين التصوير من السلوكيات الخلايا الغروية في اسماك الزرد لايف

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

في الجسم الحي بعد الولادة التثقيب الكهربائي والوقت الفاصل بين التصوير من أرومة عصبية الهجرة في الدماغ الحادة ماوس شرائح

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers الاغاروز لفترة طويلة التصوير الكالسيوم من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر من الخلايا العصبية المهاجرة في شريحة عضوي نمط ثقافة الفأر الجنينية باستخدام الدماغ<em&gt; في أوتيرو</em&gt; إليكتروبوراتيون

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

الفاصل الزمني التصوير الحي والقياس الكمي لديناميات فرع التقشر السريع في تطوير الخلايا العصبية Drosophila

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

على المدى الطويل، زراعة خالية من المصل من النباتات الشبكية الماوس Organotypic مع ظهارة صبغة الشبكية سليمة

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...